劉星辰，呂泓玥，金揚(yáng)湖，周 超

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022）

1980 年代中期人造納米技術(shù)發(fā)展迅速，納米材料被廣泛應(yīng)用于電氣，醫(yī)學(xué)和材料領(lǐng)域[1]。近年來納米工藝愈加完善，納米消費(fèi)品使用量日益增加，天然及人工合成的納米材料不可避免地被排入海洋、湖泊等環(huán)境，成為亟待解決的環(huán)境污染問題之一。納米銀顆粒作為已被廣泛應(yīng)用的納米顆粒之一，于微電子領(lǐng)域及醫(yī)用消毒領(lǐng)域占據(jù)重要地位，每年天然開采以及人工合成的數(shù)量都在上升[2-4]。早有研究表明，納米銀顆粒于天然水中釋放銀離子，且觀察到不同大小和形狀的納米銀脅迫導(dǎo)致天然水域生物受到毒性作用[5]。已證明納米銀顆粒對大多數(shù)生物組織和生物體有毒性作用，例如細(xì)菌、人類、哺乳動(dòng)物及藻類等[6-8]，所以研究納米銀對海洋生態(tài)系統(tǒng)毒性作用機(jī)制已迫在眉睫。

橈足類作為海洋種群數(shù)量最大的類群之一，憑借對各類污染物高度敏感性，常作為優(yōu)異海洋污染物監(jiān)測的模式生物[9-10]。水蚤作為最早人工養(yǎng)殖的濾食性橈足類，廣布于溫帶及亞熱帶地區(qū)，與輪蟲、鹵蟲同為經(jīng)濟(jì)崽魚的開口餌料，占據(jù)海洋生物食物鏈的特殊地位，對海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)及污染監(jiān)控與防范具有重大意義[11]。本研究樣品為湯氏紡錘水蚤Acartia tonsa，個(gè)體尺寸小，成幼體形態(tài)結(jié)構(gòu)差異大，對外界刺激敏感，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可大規(guī)模培養(yǎng)，故可作海洋生態(tài)毒理學(xué)模式生物，其毒理學(xué)相關(guān)研究對海洋海域生態(tài)指標(biāo)評定有重要指示作用[12]。

本文通過研究不同環(huán)境濃度暴露下納米銀對湯氏紡錘水蚤生殖力、酶活力水平及抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，探究納米銀暴露時(shí)間增加是否會導(dǎo)致其顆粒于水蚤體內(nèi)富集，探究湯氏紡錘水蚤對納米銀刺激相關(guān)應(yīng)激效應(yīng)機(jī)制，為海洋納米銀污染監(jiān)控及治理奠定基礎(chǔ)，為橈足類生態(tài)毒理學(xué)評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻餌料培養(yǎng)

培養(yǎng)湯氏紡錘水蚤所用微藻餌料為球等鞭金藻Isochrysis galbana Parke（Iso）、波海紅胞藻Rhodmonas baltica Karsten（Rhodo）及Rhinomonas reticulate Lucas（Rhino）3 種海水微藻。微藻藻種皆由意大利環(huán)境保護(hù)所提供，于實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)世代培養(yǎng)。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件：溫度（20±0.5）℃，海水鹽度30，光照條件（12 h光照：12 h 黑暗），光照強(qiáng)度為2 000 lx。每日監(jiān)測微藻密度，微藻生長至指數(shù)生長期時(shí)及時(shí)補(bǔ)充海水F/2 培養(yǎng)基[13]。微藻藻種每半個(gè)月保種1 次，將微藻無菌接種至含F(xiàn)/2 培養(yǎng)基的50 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并置于搖床上培養(yǎng)。

1.2 水蚤樣品

研究所用湯氏紡錘水蚤初代水蚤樣品取自亞德里亞海瀉湖區(qū)，于浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心浮游生物實(shí)驗(yàn)室連續(xù)世代培養(yǎng)。水蚤樣品置于3 L 培養(yǎng)缸中培養(yǎng)，成體投喂Iso-Rhino 及Rhodo，幼體投喂Iso，其余培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)期間氣泵不間斷補(bǔ)氧，定期調(diào)整氣泵大小，保證產(chǎn)生氣泡不影響水蚤正常運(yùn)動(dòng)。培養(yǎng)過程中定期換水（海水取自舟山市長峙島攬?jiān)潞Y網(wǎng)粗濾后，0.45 μm 濾膜進(jìn)行抽濾，高溫滅菌后備用）、清理培養(yǎng)缸底藻渣及水蚤糞便，并且定期進(jìn)行湯氏紡錘水蚤成幼體分離培養(yǎng)[14]。

1.3 儀器

RXZ-500D 智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SZ650BP 雙目體式顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；BM-37XB 倒置生物顯微鏡（上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司）；TRIzon RNA 提取液（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）。

1.4 急性、半慢性試驗(yàn)

解剖鏡下用篩網(wǎng)分離培養(yǎng)體系中湯氏紡錘水蚤成及幼體，挑取500 只個(gè)體健康、肢體完整湯氏紡錘水蚤成體，于5 L 培養(yǎng)缸中暫養(yǎng)3 d，投喂4×105cell·mL-1微藻Iso，每日利用血細(xì)胞計(jì)算表計(jì)算剩余微藻濃度并補(bǔ)充餌料。其間保證曝氣，確保水蚤無大規(guī)模死亡，移除暫養(yǎng)過程中產(chǎn)生的卵，試驗(yàn)開始取新鮮卵。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)立湯氏紡錘水蚤卵納米銀急性毒理試驗(yàn)納米銀梯度濃度：0、0.1、0.5、1、2.5 和5 mg·L-1[15]，每個(gè)濃度組設(shè)定12 個(gè)平行，每孔放置10 枚健康紡錘水蚤卵，納米銀持續(xù)暴露48 h，光照（12 h 光照：12 h 黑暗），溫度20 ℃，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得到急性48 h-EC50=0.67 mg·L-1。依據(jù)納米銀對湯氏紡錘水蚤卵急性48 h-EC50設(shè)定半慢性毒理試驗(yàn)濃度組：0、0.01、0.1、0.5 和1 mg·L-1，處理同上，持續(xù)刺激7 d，其他條件同上，計(jì)算得到卵半慢性7 d-EC50=0.2 mg·L-1。

1.5 慢性毒理試驗(yàn)

根據(jù)納米銀對湯氏紡錘水蚤卵的半慢性7 d-EC50，設(shè)立湯氏紡錘水蚤納米銀慢性毒理試驗(yàn)濃度為0，0.2 及0.4 mg·L-1，分別挑取1 對健康及肢體完整的雌雄湯氏紡錘水蚤置于100 mL 結(jié)晶皿，每組設(shè)立16個(gè)平行試驗(yàn)，培養(yǎng)條件同上，水蚤于納米銀下暴露4 d，隔天轉(zhuǎn)移個(gè)體至新結(jié)晶皿，毒性刺激體系保持一致。觀察記錄成體死亡情況，若雄性個(gè)體死亡則補(bǔ)充雄體，雌性個(gè)體死亡則視為試驗(yàn)失敗。其間分別記錄湯氏紡錘水蚤納米脅迫下的產(chǎn)卵量，卵孵化率以及排便量。

1.6 超氧化物歧化酶SOD 蛋白酶活性測定

挑取健康且肢體完整湯氏紡錘水蚤成體，暫養(yǎng)3 d。根據(jù)半慢性7 d-EC50設(shè)定0、1/8 EC50、1/4 EC50和1/2 EC50濃度組，每組50 只取形態(tài)大小差異小、運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的成體置于100 mL 結(jié)晶皿中，培養(yǎng)體系為50 mL，其間正常投喂餌料，其他條件同上，進(jìn)行慢性毒理試驗(yàn)。設(shè)立取樣時(shí)間點(diǎn)：0、24、36、48、72 和96 h，將各個(gè)組各時(shí)間點(diǎn)的湯氏紡錘水蚤置于1.5 mL 離心管，加生理鹽水至1 mL，4 ℃暫存。冰浴條件下，研磨槍破碎水蚤樣品2 min，于4 ℃離心3 000 r·min-110 min，取上清液0.1 mL，按樣品比生理鹽水比例為1：9，稀釋成1%勻漿，使用南京建成總蛋白含量測定試劑盒，分別測定各個(gè)樣品OD 值，根據(jù)總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得湯氏紡錘水蚤總蛋白含量（mg prot·mL-1）。稀釋樣用南京建成超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒測定OD 值，結(jié)合總蛋白含量計(jì)算得納米銀脅迫后湯氏紡錘水蚤SOD 平均活力水平（U·mg-1prot）。

1.7 Ferritin 及Hsp70 基因表達(dá)水平測定

挑取健康且肢體完整湯氏紡錘水蚤成體50 只，暫養(yǎng)3 d。根據(jù)半慢性7 d-EC50設(shè)定0、1/8 EC50、1/4 EC50和1/2 EC50濃度組，處理?xiàng)l件同上，進(jìn)行慢性毒理試驗(yàn)。設(shè)立取樣時(shí)間點(diǎn)0、24、48、72 和96 h，將30 只水蚤成體置于1.5 mL 離心管。設(shè)計(jì)湯氏紡錘水蚤Hsp70 及Ferritin 基因的熒光定量PCR 引物及1 對βactin 基因（內(nèi)參基因）引物，通過Trizol 試劑提取法提取水蚤RNA 后，通過TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板，對上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-qPCR 試驗(yàn)，目的基因與內(nèi)參各設(shè)置10 個(gè)技術(shù)重復(fù)，排除重復(fù)組別中差異較大的數(shù)據(jù)，其余數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行基因表達(dá)分析。引物見表1。

表1 湯氏紡錘水蚤Hsp70 及Ferritin 基因熒光定量PCR 引物Tab.1 RT-PCR primers for Hsp70 and Ferritin genes in A.tonsa

1.8 結(jié)果計(jì)算及數(shù)據(jù)處理

湯氏紡錘水蚤孵化率計(jì)算：統(tǒng)計(jì)放置的新卵、孵化后的空卵及無節(jié)幼體數(shù)量進(jìn)行綜合計(jì)數(shù)，攝食力通過統(tǒng)計(jì)糞便數(shù)計(jì)算。研究相關(guān)數(shù)據(jù)擬用SPSS25.0 軟件進(jìn)行顯著性及方差分析，最終計(jì)算結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤產(chǎn)卵量及卵孵化率的影響

研究結(jié)果顯示，納米銀慢性毒理試驗(yàn)毒性積累具備時(shí)間效應(yīng)。湯氏紡錘水蚤受納米銀脅迫時(shí)間增加，導(dǎo)致其產(chǎn)卵量逐日下降（圖1）。暴露于0.2 mg·L-1納米銀下，湯氏紡錘水蚤前兩日產(chǎn)卵量未受到影響，24 h 均產(chǎn)（11±1.5）枚卵，48 h 均產(chǎn)卵（11.5±1.7）枚。水蚤72 h 時(shí)產(chǎn)卵量開始出現(xiàn)下降趨勢，均產(chǎn)（10±0.9）枚卵，且于96 h 時(shí)有最低均產(chǎn)卵量為（6.1±1.8）枚（P＜0.05），產(chǎn)卵量相比對照組下降了58.8 %。隨著納米銀濃度增加，水蚤產(chǎn)卵量顯著下降。湯氏紡錘水蚤暴露于0.4 mg·L-1納米銀下，24 h 均產(chǎn)卵（8.1±1.6）枚，48 h 均產(chǎn)卵（6.3±1.2）枚，72 h時(shí)均產(chǎn)卵（5.3±1.3）枚，96 h 時(shí)有最低均產(chǎn)卵量為（2.9±0.6）枚（P＜0.05），各個(gè)時(shí)間段產(chǎn)卵量相較于對照組及0.2 mg·L-1納米銀組都有顯著下調(diào)。

圖1 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤產(chǎn)卵量的影響Fig.1 Effect of Ag NPs exposure on egg production of A.tonsa spawning quantity

研究發(fā)現(xiàn)卵孵化率與產(chǎn)卵量變化趨勢相似，納米銀暴露也會導(dǎo)致湯氏紡錘水蚤的卵孵化率顯著性下降，且濃度越高，平均卵孵化率與對照組差異越大（圖2）。0.2 mg·L-1納米銀暴露下，湯氏紡錘水蚤新卵孵化率低于對照組卵孵化率（P＜0.05），隨著暴露時(shí)間增加，卵孵化率分別為24 h（65.5±3.1）%，48 h（58.84±4.2）%，72 h（56.09±5.3）%，96 h 孵化率下降至最低值（44.89±4.1）%。0.4 mg·L-1納米銀作為高濃度組，組內(nèi)卵孵化率相較于對照組和0.2 mg·L-1納米銀組有顯著差異，24 h及48 h 孵化率無明顯下降，72 h 孵化率為（31.54±2.2）%，96 h有最低孵化率為（15.71±4.1）%，2 個(gè)時(shí)間段卵孵化率顯著性降低（P＜0.05）。

圖2 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤卵孵化率的影響Fig.2 Effect of Ag NPs exposure on hatching rate of A.tonsa eggs

2.2 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤排便量的影響

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米銀暴露使水蚤攝食力大幅下降（圖3）。湯氏紡錘水蚤饑餓馴化24 h 后，相比于對照組水蚤的排便量，試驗(yàn)組排便量顯著性減少。0.2 mg·L-1納米銀組于24 及48 h 下降幅度較小，從72 h 觀察到（79.8±11.9）個(gè)糞便（P＜0.05），96 h 時(shí)有最低排便量（56.8±9.2）個(gè)糞便（P＜0.05）。0.4 mg·L-1納米銀暴露下，湯氏紡錘水蚤排便量遠(yuǎn)低于對照組，呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，24 h 平均糞便量（70.7±7.8）個(gè)，48 h 平均糞便量（56.5±5.1）個(gè)，72 h 平均糞便量（49.8±9.1）個(gè)，96 h 觀察到最低平均糞便量（27.1±12.2）個(gè)。納米銀慢性脅迫下，湯氏紡錘水蚤排便量受納米銀濃度及暴露時(shí)間調(diào)控。

圖3 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤排便量的影響Fig.3 Effect of silver nanometer exposure on fecal pellet of A.tonsa

2.3 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤SOD 蛋白酶活性的影響

納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤SOD 蛋白酶活力影響見圖4，可知納米銀脅迫下12 h 時(shí)SOD 酶活皆受到抑制，1/2 EC50納米銀暴露下平均SOD 酶活為（27.5±4.8）U·mg-1prot 遠(yuǎn)低于對照組（48.6±4.5）U·mg-1prot。1/8 EC50納米銀于24 h 時(shí)有最高SOD 酶活（67.6±8.5）U·mg-1prot（P＜0.05），該濃度組SOD 活力水平隨后回復(fù)正常水平。48 h 時(shí)2 個(gè)高濃度組SOD 活力水平都到達(dá)峰值，1/4 EC50SOD 平均酶活為（92.2±3.9）U·mg-1prot（P＜0.01），1/2 EC50納米銀脅迫下SOD 平均酶活為（70.3±3.1）U·mg-1prot（P＜0.05）。72 h 之后1/4 EC50及1/8 EC50組SOD 酶活恢復(fù)正常水平，而1/2 EC50納米銀脅迫抑制SOD合成及酶活力，活性水平遠(yuǎn)低于對照組水平（P＜0.05）。

圖4 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤SOD 酶活水平的影響Fig.4 Effect of Ag NPs exposure on SOD enzyme activity of A.tonsa

2.4 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤Ferritin 及Hsp70 基因表達(dá)水平的影響

通過RT-PCR 對湯氏紡錘水蚤Ferritin 及Hsp70 基因，以湯氏紡錘水蚤β-action 為內(nèi)參基因，選取對照組湯氏紡錘水蚤表達(dá)水平作為參照，每個(gè)處理進(jìn)行3 次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果表明，納米銀脅迫湯氏紡錘水蚤，其Ferritin 及Hsp70 基因于不同時(shí)間段及不同濃度組下呈現(xiàn)出差異性表達(dá)（圖5，圖6）。

圖5 納米銀對湯氏紡錘水蚤Ferritin 基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Experssion level of Ferritin in A.tonsa with Ag NPs exposure

圖6 納米銀對湯氏紡錘水蚤Hsp70 基因表達(dá)水平的影響Fig.6 Experssion level of Hsp70 in A.tonsa with Ag NPs exposure

分析結(jié)果如下：不同濃度納米銀脅迫下湯氏紡錘水蚤Ferritin 基因mRNA 表達(dá)24 h 時(shí)皆有顯著性低量表達(dá)，1/2 EC50納米銀暴露下有最低表達(dá)量僅對照組表達(dá)水平0.13 倍；48 h 時(shí)1/2 EC50有最大表達(dá)量，1/4 EC50表達(dá)水平到達(dá)峰值（P＜0.05）；72 h 除1/8 EC50組表達(dá)量到達(dá)峰值后（P＜0.05），其余組別皆呈現(xiàn)下降趨勢；水蚤受納米銀脅迫96 h 后，各組Ferritin 基因表達(dá)水平相對回落。Hsp70 基因mRNA 表達(dá)量于納米銀脅迫下24 h 同為低量表達(dá)；48 h 時(shí)1/2EC50表達(dá)量到達(dá)峰值（P＜0.05），其余組別依舊為低表達(dá)；1/8 EC50及1/4 EC50納米銀組于72 h 時(shí)有最高表達(dá)量（P＜0.05）。高濃度納米銀脅迫對Ferritin 及Hsp70 表達(dá)量的抑制遠(yuǎn)高于低濃度納米銀組，說明納米銀脅迫對2 種基因表達(dá)水平存在時(shí)間效應(yīng)及濃度效應(yīng)。

3 討論

湯氏紡錘水蚤作為典型海洋濾食性浮游生物，因自身缺乏作為排毒器官的肝胰腺，消化道僅由一層上皮細(xì)胞組成，并負(fù)責(zé)水蚤消化道的消化作用。ZHOU，et al[16]通過電鏡發(fā)現(xiàn)湯氏紡錘水蚤成體會攝入附著納米鎳顆粒的微藻，并在消化道上富集，導(dǎo)致機(jī)體攝食力降低。研究發(fā)現(xiàn)50 nm 左右的納米材料不但可以滲透到水蚤的消化器官，甚至于生殖器官和胚胎都可以發(fā)現(xiàn)納米顆粒存在[17]。結(jié)果顯示納米顆粒暴露導(dǎo)致湯氏紡錘水蚤產(chǎn)卵量顯著下降，說明具備小尺寸效應(yīng)的納米銀顆粒能夠進(jìn)入水蚤體內(nèi)，從消化道轉(zhuǎn)移至生殖器官，對水蚤產(chǎn)生生殖毒性[18]。隨暴露時(shí)間及納米銀濃度增加，毒性積累越多，對水蚤生殖能力抑制越強(qiáng)。LEE，et al[19]研究發(fā)現(xiàn)納米顆?？梢酝ㄟ^胚胎絨毛膜孔，直接脅迫胚胎發(fā)育。納米銀可導(dǎo)致斑馬魚Danio rerio 絨毛膜上氧氣交換效率降低或停滯，造成胚胎孵化延遲、心率降低、心包水腫和胚胎死亡。湯氏紡錘水蚤卵孵化率同樣隨納米銀濃度及時(shí)間增加而降低，這可能是水蚤成體在納米銀暴露時(shí)攝入納米銀顆粒，進(jìn)入生殖系統(tǒng)，穿刺水蚤卵細(xì)胞，干預(yù)卵細(xì)胞生長發(fā)育；另一種可能是卵直接暴露在納米銀環(huán)境中，小顆粒或游離的銀離子通過細(xì)胞膜進(jìn)入水蚤卵，抑制水蚤卵細(xì)胞發(fā)育，并產(chǎn)生致死作用。

水環(huán)境中納米顆粒團(tuán)聚、沉降行為是評估其水環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)的重要憑證[20]。目前研究表明，納米材料團(tuán)聚及沉降對水環(huán)境底棲生物更有威脅。納米材料由于自身尺寸較小，相對比表面積大、表化學(xué)能高，環(huán)境中的納米顆粒會自發(fā)團(tuán)聚，或結(jié)合其他有機(jī)物、有害物質(zhì)形成復(fù)合體[21]。AAL，et al[22]發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦團(tuán)聚，會增加其在水環(huán)境中的停滯時(shí)間，增加其被水體食物鏈富集可能性，從而對高等生物產(chǎn)生毒性迫害。納米銀顆粒憑借范德華力、靜電力等作用力，納米銀顆粒自發(fā)團(tuán)聚，于水蚤體運(yùn)動(dòng)器官上富集，導(dǎo)致水蚤運(yùn)動(dòng)能力大幅下降，干擾生命活動(dòng)，其中攝食力大幅度下降，排便量也相應(yīng)地減少。納米銀顆粒也能通過攝食途徑被湯氏紡錘水蚤成體攝入，于其體內(nèi)富集，并積累在消化道內(nèi)，造成水蚤消化能力減弱，觀察到的糞便量也因此減少。研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅顆粒會導(dǎo)致大型蚤肢體受損，體內(nèi)脂類過氧化，能量儲備能力下降。而通過攝食的納米顆粒會導(dǎo)致水蚤體內(nèi)與氧運(yùn)輸和抗氧化酶有關(guān)的指數(shù)下降[23]。因此納米銀顆粒進(jìn)入湯氏紡錘水蚤正常健康細(xì)胞中，可能引起各種細(xì)胞功能的自我調(diào)節(jié)，如發(fā)生氧化應(yīng)激、細(xì)胞本身或細(xì)胞器膜的損傷。湯氏紡錘水蚤在納米銀脅迫之下，游離銀離子對其器官細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化反應(yīng)，并在暴露初期不徹底破壞其抗氧化系統(tǒng)情況下，短期內(nèi)促進(jìn)機(jī)體合成超氧化物歧化酶對抗這種氧化反應(yīng)，但隨著暴露時(shí)間及納米銀濃度增加，對水蚤抗氧化系統(tǒng)會造成不可逆的損傷，SOD 酶合成水平逐漸下降，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體生殖能力、運(yùn)動(dòng)能力下降，并機(jī)體逐漸失去活力或者死亡。

熱激蛋白作為應(yīng)激類功能蛋白家族，在細(xì)胞受到刺激就會大量合成。Hsp70 是熱激蛋白家族中研究比較透徹的一種，能對抗外界不利因素。Ferritin 鐵蛋白存在于各種有機(jī)體體內(nèi)，參與儲存及釋放鐵離子，同樣可以反映機(jī)體對外界環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus 暴露在納米塑料顆粒中，水蚤體內(nèi)活性氧水平上升，抗氧化劑相關(guān)的基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)，抗氧化酶的活性顯著變化[18]。研究表明暴露于納米銀中的奧利亞羅非魚，其所有組織中均觀察到高水平的Hsp70 表達(dá)，加之肌肉、腎臟和肝臟等免疫組織化學(xué)染色反映了羅非魚Oreochromis mossambicus 對納米顆粒強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)[24]。本研究中納米銀脅迫湯氏紡錘水蚤Hsp70 及Ferritin 2 個(gè)基因，二者的表達(dá)水平存在相對時(shí)間效應(yīng)及相對濃度效應(yīng)。納米銀初脅迫對水蚤機(jī)體造成損傷，24 h 有顯著低量表達(dá)。試驗(yàn)期間會產(chǎn)生表達(dá)峰值，到達(dá)峰值后，反而會呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，說明湯氏紡錘水蚤成體長期暴露下會產(chǎn)生基因毒性，且這個(gè)毒性會隨時(shí)間積累。2 種基因變化趨勢說明湯氏紡錘水蚤機(jī)體會受納米銀脅迫，受到氧化損傷，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，Hsp70和Ferritin 短期內(nèi)會大量表達(dá)，隨著毒性積累超過水蚤能夠承受的閾值，可能會影響湯氏紡錘水蚤的生殖能力及攝食能力，同樣可能造成抗氧化相關(guān)基因不可逆的損傷，甚至因體內(nèi)ROS 過量導(dǎo)致死亡。

綜上所述，納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤生殖力，酶活力以及抗氧化基因表達(dá)水平皆存在較強(qiáng)抑制作用。水蚤體內(nèi)抗氧化機(jī)制存在納米銀低濃度初期誘導(dǎo)，長期及高濃度暴露有顯著抑制趨勢，因此湯氏紡錘水蚤對納米銀脅迫的響應(yīng)存在著明顯的時(shí)間效應(yīng)以及濃度效應(yīng)。本文通過研究納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤生理指標(biāo)、酶活力指標(biāo)及基因表達(dá)水平響應(yīng)機(jī)制，從生態(tài)毒理學(xué)層面初步分析納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤的毒性作用機(jī)制，為海洋橈足類毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為海洋納米銀污染監(jiān)控及治理提供監(jiān)測手段。