詹 瑛,王 斌,王 宏,邢海星,張建芳,馮云云

(1解放軍63750部隊(duì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710043;2空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;3西安市大興醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:zhzhhao@163.com)

甲基丙二酸血癥(methylmalonic acidemia,MMA)是由于甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)自身缺陷或其輔酶腺苷鈷胺素(Ado-Cbl)代謝缺陷而導(dǎo)致甲基丙二酸/丙酸/甲基檸檬酸等代謝產(chǎn)物異常堆積而引起的疾病,致死率、致殘率高,是我國(guó)最常見(jiàn)的有機(jī)酸代謝障礙性疾病[1]。我國(guó)新生兒發(fā)病率為1/26 000～1/3 920,是一種常染色體隱性遺傳病[2]。與甲基丙二酸血癥相關(guān)的基因有14個(gè),其中比較常見(jiàn)的有MUT、MMAA、MMAB、MMADHC、MMACHC、LMBRD1、SLC22A5等,我國(guó)較常見(jiàn)的類型為MMACHC基因變異導(dǎo)致的Cb1C型和MUT基因變異導(dǎo)致的單純性甲基丙二酸血癥[3]。MMA患兒臨床可表現(xiàn)為嗜睡、嘔吐、抽搐、肌張力低下、運(yùn)動(dòng)及智力障礙等。MMA臨床表型異質(zhì)性強(qiáng),臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度不一,可病情危重甚至是死亡,也可以僅有輕微甚至無(wú)任何癥狀,及時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的相關(guān)致病基因檢測(cè)對(duì)MMA患者的診斷、治療和預(yù)后尤為重要[4]。

本研究基于二代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)采用目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序技術(shù)中最常用的Panel技術(shù)對(duì)一個(gè)甲基丙二酸血癥家系進(jìn)行MMA相關(guān)致病基因檢測(cè),再結(jié)合PCR和Sanger測(cè)序在該家系中進(jìn)行驗(yàn)證,從遺傳學(xué)的角度初步明確了該家系中先證者M(jìn)MA的可能發(fā)病原因,為其臨床診斷提供了有力的證據(jù),為該家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了可靠的分子依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

患兒為2018年12月西安市兒童醫(yī)院新生兒科收治的1例足月產(chǎn)男嬰,臨床表現(xiàn)為出生后氣促、呻吟不安、肌張力低下、喂養(yǎng)困難?；純焊改鸽p方非近親結(jié)婚,否認(rèn)家族中遺傳病史。曾于2016年7月在陜西省富平縣婦幼保健院足月順產(chǎn)1女,出生后表現(xiàn)為喂養(yǎng)困難、氣促、肌張力差,新生兒科診斷為“甲基丙二酸血癥”,建議轉(zhuǎn)往上一級(jí)醫(yī)院新生兒科進(jìn)一步診療,因患兒家庭客觀原因放棄治療后患兒于10日齡時(shí)夭折。2018年12月該家系母親足月順產(chǎn)1男嬰，臨床表現(xiàn)與前一胎患兒相似，遂緊急轉(zhuǎn)往西安市兒童醫(yī)院進(jìn)一步診療?；純喝朐汉蠡?yàn)指標(biāo)顯示酸中毒PCO224 mmHg，HCO3-5.8 mmol/L，低血糖1.0 mmol/L，高血氨127 μmol/L，高乳酸16 mmol/L。血?dú)庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)合有機(jī)酸分析結(jié)果顯示丙?；鈮A/乙酰基肉堿比值升高，診斷為甲基丙二酸血癥，為明確病因遂留取患兒及父母外周血進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和Panel檢測(cè) 該家系夫妻雙方簽署知情同意書后,采用EDTA抗凝管抽取患兒及其父母雙方靜脈血各4 ml,按血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取外周血基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆??；純篋NA樣本送至北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,利用Sure Select Target Enrichment System目標(biāo)序列富集試劑盒構(gòu)建文庫(kù),篩選出574個(gè)遺傳代謝病相關(guān)基因制定遺傳代謝病目標(biāo)基因捕獲試劑盒捕獲外顯子及部分內(nèi)含子區(qū)域,應(yīng)用NEXTSEQ 500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行二代測(cè)序,數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后與基因組參考序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)合該家系MMA的臨床表型、遺傳方式等查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析判斷可疑變異的致病性。

1.2.2 PCR和Sanger測(cè)序在家系中進(jìn)行基因變異的共分離驗(yàn)證 根據(jù)Panel檢測(cè)的結(jié)果,用PCR結(jié)合Sanger測(cè)序?qū)純杭捌涓改高M(jìn)行突變檢測(cè)和驗(yàn)證。針對(duì)MUT基因的c.753+1delinsTGGTTATT和c.911+1G>C位點(diǎn)采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)跨越2號(hào)、3號(hào)外顯子上下游的引物序列。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),之后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證MUT基因突變致病性 患兒外周血細(xì)胞RNA的提取采用TianGen RNA提取試劑盒(TianGen,DP419),使用Prime-ScriptTM試劑(Takara Dalian,RR036A)將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,依據(jù)MUT基因的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,MUT-2F:GTGGATACCATATGCAGGAAGC,R:GCACAGTGGATCCCAAAACATT;MUT-5F:AAGAGGCACTAAACACTG,R:CTACCCTACTAGGAAAGC。總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)、國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)(ClinVar)及在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析判斷其致病性。

2 結(jié)果

2.1 MMA家系可疑致病基因及位點(diǎn)的確定

患兒基因組DNA經(jīng)Panel檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其MUT基因存在c.753+1delinsTGGTTATT變異和c.911+1G>C變異的兩處復(fù)合雜合突變,兩處變異在人群數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中均未見(jiàn)報(bào)道(見(jiàn)圖1)。查閱ClinVar與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)MUT基因與甲基丙二酸血癥相關(guān)。甲基丙二酸血癥為常染色體隱性遺傳病,上述兩處變異均為MUT基因內(nèi)含子區(qū)域的變異,其中c.753+1delinsTGGTTATT位點(diǎn)變異位于MUT基因2號(hào)內(nèi)含子下游,緊鄰3號(hào)外顯子,c.911+1G>C位點(diǎn)的變異位于MUT基因3號(hào)內(nèi)含子+1位,均處于“經(jīng)典剪接區(qū)域”,該區(qū)域的堿基突變一般均會(huì)對(duì)原剪切位點(diǎn)產(chǎn)生影響,高度懷疑會(huì)影響轉(zhuǎn)錄水平內(nèi)含子序列的剪切,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功能。

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示患病胎兒MUT基因c.753+1delinsTGGTTATT變異和c.911+1G>C變異分別來(lái)自該家系中的母親及父親,其父母分別為上述雜合突變的攜帶者,該遺傳方式符合常染色體隱性遺傳(見(jiàn)圖2),如果上述兩處變異為致病性突變,該家系再次妊娠有1/4的概率生育患者。

圖1 MMA家系患兒MUT基因變異位點(diǎn)在基因序列中的位置Figure 1 The location of the fetal mutations of MUT gene in a family with MMA

2.3 基因突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后mRNA異常的結(jié)果

將患兒總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),測(cè)序結(jié)果提示該患兒MUT基因的復(fù)合雜合突變使得轉(zhuǎn)錄過(guò)程異常,出現(xiàn)多種異常的轉(zhuǎn)錄本。測(cè)序結(jié)果表明其中一種轉(zhuǎn)錄本缺失了3號(hào)外顯子c.679-c.753這一段堿基序列;另一種轉(zhuǎn)錄本缺失了3號(hào)外顯子c.546-c.753序列以及4號(hào)外顯子c.754-c.779序列的堿基,同時(shí)缺失的堿基替換為4號(hào)外顯子序列(見(jiàn)圖3)。

圖3 胎兒MUT基因突變后mRNA水平的變化Figure 3 Changes of mRNA level in the fetus after mutation of MUT gene

3 討論

甲基丙二酸血癥是一種常染色體隱性遺傳方式的有機(jī)酸代謝性疾病,它的致病基因及臨床表型具有高度的異質(zhì)性,MMA臨床癥狀主要為代謝性酸中毒,拒食、呼吸困難及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等可以導(dǎo)致新生兒早期死亡或兒童期危重的神經(jīng)功能障礙[4],臨床危害嚴(yán)重,本研究中的患兒最終因嚴(yán)重的酸中毒而死亡。目前該病在全國(guó)各地區(qū)的發(fā)病情況不明,陜西省報(bào)道該地區(qū)疾病發(fā)生率為1/6 960,而其他地區(qū)發(fā)病率略有升高[5-7]。國(guó)內(nèi)MMA患者60%～80%是以MMACHA基因突變引起的合并型MMA,cblC缺陷是其主要病因,而MUT基因引起的單純型MMA居于次位[2,8]。

MUT基因定位于6p21,全長(zhǎng)約35 kb,內(nèi)含13個(gè)外顯子,編碼甲基丙二酰輔酶A變位酶MCM[9],該酶是由兩個(gè)相同亞基組成的同源二聚體,包含兩個(gè)主要的功能結(jié)合區(qū):底物結(jié)合區(qū)和鈷胺素結(jié)合區(qū),兩個(gè)功能區(qū)之前存在連接區(qū),MUT基因變異引起氨基酸序列的變化導(dǎo)致MCM酶蛋白功能異常均可能導(dǎo)致單純型MMA疾病的發(fā)生。本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)經(jīng)血液、血?dú)庀嗌V/質(zhì)譜串聯(lián)檢查高度懷疑為甲基丙二酸血癥的新生兒家系進(jìn)行了Panel檢測(cè),發(fā)現(xiàn)患兒患單純型MMA,患兒MUT基因存在c.753+1delinsTGGTTATT和c.911+1G>C的復(fù)合雜合變異,此兩處變異均為剪切變異,Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示家系中存在遺傳共分離現(xiàn)象,MUT基因很可能為該MMA家系的致病基因。截止2021年10月,ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)目前已經(jīng)報(bào)道的MUT基因致病或可能致病的變異位點(diǎn)有460個(gè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/),而本研究發(fā)現(xiàn)的兩處可疑致病位點(diǎn)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)學(xué)者王斐等[10]對(duì)甲基丙二酸血癥患兒的MUT基因突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)研究,突變頻率較高的位點(diǎn)為c.323G>A、c.729-730insTT與c.1630-1631GG>TA,且MUT基因的變異方式以錯(cuò)義突變多見(jiàn)。而本研究中患兒MUT基因是兩處剪切突變的復(fù)合雜合突變,經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)這兩處剪切突變導(dǎo)致患兒MUT基因的轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)異常,其中一種轉(zhuǎn)錄本缺失了3號(hào)外顯子c.679-c.753這一段堿基序列;另一種轉(zhuǎn)錄本缺失了3號(hào)外顯子c.546-c.753序列以及4號(hào)外顯子c.754-c.779序列的堿基,同時(shí)缺失堿基替換為4號(hào)外顯子序列,這就顯著地影響了氨基酸的序列,進(jìn)而影響到MCM蛋白的功能。已經(jīng)有研究證實(shí)c.755dupA可以導(dǎo)致甲基丙二酸血癥[11],說(shuō)明MUT基因這一堿基附近的變異對(duì)蛋白功能影響很大,而本研究中的患兒也存在類似堿基序列的異常。

對(duì)于MMA患者家系來(lái)講如何實(shí)現(xiàn)疾病的阻斷、獲得健康的子代是最迫切的需求,實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵在于精準(zhǔn)的基因診斷,從而為產(chǎn)前診斷或是胚胎植入前檢測(cè)提供準(zhǔn)確、可靠的分子依據(jù),這就依賴于基因檢測(cè)技術(shù)。目前臨床中廣泛應(yīng)用的基因檢測(cè)技術(shù)有一代測(cè)序(Sanger測(cè)序)、二代測(cè)序技術(shù)(高通量測(cè)序技術(shù))。Sanger測(cè)序因?yàn)槠錅y(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì),依然被用作其他測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn),而高通量測(cè)序技術(shù)以其高通量、自動(dòng)化程度高、經(jīng)濟(jì)成本低的顯著特征[12],使遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究以前所未有的速度向前推進(jìn)。高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合微陣列技術(shù)(芯片技術(shù))衍生出了一種新的技術(shù),即目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序技術(shù)(targeting sequencing, TS),目前應(yīng)用最多的是Panel及全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing,WES)。顯然,對(duì)于Panel技術(shù)而言,它具有數(shù)據(jù)量低、費(fèi)用較低、與生物學(xué)表型有更好的相關(guān)性這些顯著的優(yōu)勢(shì),而且使得對(duì)檢測(cè)出的變異更容易做出合理解釋,同時(shí)也避免了檢出一些與疾病不相關(guān)的或是無(wú)意義的變異,加重受檢者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。因此美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)的指南建議對(duì)于經(jīng)過(guò)科學(xué)研究證實(shí)的與疾病明確相關(guān)的基因,在臨床檢測(cè)中建議使用Panel技術(shù)[13]。同時(shí)技術(shù)的進(jìn)步也導(dǎo)致了海量臨床意義不明的基因變異,其中很大的一部分就是來(lái)自剪切位點(diǎn)的變異[14]。正常的剪接過(guò)程是極其復(fù)雜的,因此我們對(duì)剪接過(guò)程的了解不能僅根據(jù)原始基因序列預(yù)測(cè)變異的最終效應(yīng)。最經(jīng)典的驗(yàn)證方式是通過(guò)使用簡(jiǎn)單的反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增技術(shù),獲得擴(kuò)大的轉(zhuǎn)錄組序列,然后與參考轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)看其是否產(chǎn)生異常剪切,該技術(shù)目前仍廣泛應(yīng)用于臨床驗(yàn)證,本研究中便是使用了該種方式進(jìn)行患兒MUT基因剪切突變的驗(yàn)證,有利地證明了兩突變個(gè)位點(diǎn)的致病性。也可以使用minigene技術(shù)或體外剪切技術(shù)對(duì)剪切變異在體外進(jìn)行驗(yàn)證,這些體外驗(yàn)證技術(shù)幫助解決了一些實(shí)際問(wèn)題,比如無(wú)法獲得先證者組織樣本的問(wèn)題。而微陣列技術(shù)的發(fā)展和RNA-seq技術(shù)的改進(jìn)解決了這一問(wèn)題,隨后出現(xiàn)的高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)直接對(duì)RNA序列進(jìn)行測(cè)序,但是迄今為止因?yàn)槠浣?jīng)濟(jì)成本較高,需要掌握大量的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析能力,還不能夠做到全面普及應(yīng)用[15]。

總而言之,對(duì)曾經(jīng)生育過(guò)MMA患兒的家系采取針對(duì)性的可疑致病基因檢測(cè)策略,可以快速、準(zhǔn)確地做出基因診斷,為患兒及家系的診斷和治療提供可靠的分子依據(jù)?？茖W(xué)地在家系中進(jìn)行可疑致病基因的驗(yàn)證,可以為患者家系下一步實(shí)施產(chǎn)前診斷或是胚胎植入前篩查打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。