趙小靜,宋 瑞,陰懷清,武師潤

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院兒科,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院兒科;*通訊作者,E-mail:yhq0351@163.com)

高膽紅素血癥是新生兒多見但不應(yīng)該忽視的一種疾病,病理性和進(jìn)行性間接高膽紅素血癥可發(fā)展為膽紅素腦病(bilirubin encephalopathy,BIE)[1]。BIE可以是短暫的和急性的(有早期、中期和晚期階段),也可以是永久性的、慢性的和終身的(兩眼不能向上凝視、感覺神經(jīng)聽力損失、牙齒發(fā)育異常和錐體外系障礙如舞蹈癥腦癱)[1,2],是導(dǎo)致新生兒神經(jīng)行為和認(rèn)知功能障礙甚至殘疾、死亡的主要原因之一。當(dāng)前主要用光療和換血療法快速降低血清中的膽紅素,但對于已進(jìn)入血腦屏障的膽紅素,其產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可使細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死,然而目前臨床上還未發(fā)現(xiàn)可以預(yù)防和減輕腦損傷的有效藥物。有研究表明,單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialote-trahexosyl ganglioside,GM1)可通過血腦屏障進(jìn)入細(xì)胞膜,重構(gòu)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)受損神經(jīng)恢復(fù),改善神經(jīng)功能[3],已被用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,但應(yīng)用于膽紅素腦病的研究尚少[4]。血清NSE被證明在反映腦損傷程度中具有較高的敏感性和特異性[5]。本實(shí)驗(yàn)研究通過建立新生7日齡高膽紅素血癥大鼠模型,觀察予以外源性GM1干預(yù)前后血清NSE的水平以及神經(jīng)元凋亡情況來評估腦組織損傷的程度,為臨床兒科醫(yī)生防治高膽紅素腦病提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膽紅素(美國Sigma公司),TUNEL試劑盒與血清NSE酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司),神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(山西國藥控股國大藥房有限公司)、NaOH粉末與濃鹽酸(山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供),二甲苯、無水乙醇、90%乙醇、PBS、DAB顯色試劑盒等則由山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供,5%水合氯醛由山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科提供。

1.2 液體配制及模型制備

1.2.1 配制膽紅素溶液 于避光條件下稱取膽紅素晶體50 mg,溶于1 ml濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液中,再加入9 ml雙蒸水,用濃度為0.5 mol/L的鹽酸將pH調(diào)至8.5,此時(shí)膽紅素溶液的濃度為5 mg/ml。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備 新生7日齡SD大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)動物中心,已通過動物倫理委員會審查),雌雄不限,體質(zhì)量10～18 g,隨機(jī)分為對照組、高膽紅素血癥模型組(模型組)、GM1組,每組各40只。模型組大鼠腹腔注射100 μg/g配制好的膽紅素溶液,對照組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水,GM1組大鼠腹腔注射100 μg/g配制好的膽紅素溶液后立即腹腔注射GM1 10 mg/kg。三組再根據(jù)各組大鼠注射藥物結(jié)束后的不同時(shí)間點(diǎn)分為6,12,24,48,72 h亞組,每個亞組8只。造模結(jié)束后,將大鼠放回原飼養(yǎng)環(huán)境由母鼠喂養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)觀察

1.3.1 病理學(xué)觀察 各組大鼠于設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn)處死(5%水合氯醛麻醉,將其固定于手術(shù)臺上,打開腹腔,充分暴露肝臟,在肝緣剪一小口,暴露心臟,用1 ml注射器從心尖部進(jìn)針抽取血液置于EP管中,靜置30 min后離心,取上清液置于管中標(biāo)記后在-80 ℃冰箱中存放,分別取裝有生理鹽水、10%多聚甲醛的20 ml注射器從心尖部進(jìn)針依次灌洗,直至肝緣小口處流出清亮的液體),斷頭取腦,置于福爾馬林溶液中固定24 h后將包含海馬區(qū)的腦組織石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察海馬區(qū)組織病理學(xué)改變。TUNEL染色觀察海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率。

1.3.2 血清學(xué)觀察 將血清標(biāo)本提前取出置于室溫下解凍,隨后用ELISA法檢測血清中NSE的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色

對照組細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)正常,未見明顯細(xì)胞水腫;模型組細(xì)胞排列愈加紊亂,空泡變性明顯,胞核溶解、碎裂、消失;GM1組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞水腫,部分可見空泡,細(xì)胞核部分消失(見圖1)。

圖1 各組新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞HE染色 (×400)Figure 1 HE staining of cells in the hippocampal regions of newborn rats in each group (×400)

2.2 TUNEL染色

與對照組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，GM1組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡減少，但仍高于對照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)

2.3 血清NSE含量

對照組血清NSE濃度較低,每個相對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)模型組血清NSE濃度均比對照組高(P<0.05),GM1組血清NSE濃度均比模型組低,但仍高于對照組,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)血清NSE濃度

3 討論

新生兒基于膽紅素代謝的特殊性,容易合并高膽紅素血癥,這是膽紅素生成和消除之間不平衡的結(jié)果[6]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示高于60%的足月兒和80%的早產(chǎn)兒患有新生兒黃疸[7],若未及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行干預(yù)和治療,極易引起膽紅素腦病,嚴(yán)重者可威脅患兒生命。目前高膽紅素血癥腦損傷的具體機(jī)制尚未清楚,現(xiàn)有的研究表明[8],低濃度的未結(jié)合膽紅素(unconjugated bilirubin,UCB)可以通過抗氧化起神經(jīng)保護(hù)作用,而過量的UCB常沉積于基底節(jié)區(qū),且感染蒼白球、黑質(zhì)、海馬區(qū)等位置的頻率較高,從而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。近些年的研究推翻了臨床上常以膽紅素指標(biāo)對高膽紅素血癥等進(jìn)行診斷及預(yù)后的做法,腦內(nèi)膽紅素濃度、膽紅素暴露的時(shí)間、神經(jīng)元易感性及血腦屏障的功能狀態(tài)成為更為重要的考慮因素[6],溶血病患兒或早產(chǎn)兒出生后幾天內(nèi)的膽紅素濃度會急劇升高,若此時(shí)才對患兒進(jìn)行干預(yù)則極有可能錯過最佳治療時(shí)機(jī),使患兒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷現(xiàn)象,進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重膽紅素腦病[9]。因此,尋找更為敏感和特異的檢測指標(biāo)及治療策略尤為重要。

NSE特異性定位在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。其在血清中是穩(wěn)定的,不受非神經(jīng)元特異性烯醇化酶交叉反應(yīng)的影響[10,11]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示血清NSE的高低可評估在缺氧、缺血、動脈低血壓和高血壓等損害因素的進(jìn)展過程中腦細(xì)胞損傷的程度[12],血清濃度與腦損傷程度成正比[13]。

神經(jīng)節(jié)苷脂在脊椎動物的神經(jīng)組織中高水平且持續(xù)表達(dá)[14],并在許多細(xì)胞生理過程中扮演著重要角色,包括細(xì)胞分化、細(xì)胞信號、神經(jīng)元保護(hù)、神經(jīng)元修復(fù)和細(xì)胞凋亡等[3]。GM1可穿過血腦屏障,有研究表明[15],它是細(xì)胞膜的組成成分,與調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)元分化、G蛋白偶聯(lián)受體、免疫系統(tǒng)再激活和神經(jīng)保護(hù)信號等機(jī)制的蛋白質(zhì)相互作用,發(fā)揮其在神經(jīng)系統(tǒng)中潛在的治療作用;它還刺激內(nèi)源性NGF的合成,共同發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生[16]。

健康人的血清NSE水平正常較低,在腦損傷狀態(tài)下,神經(jīng)元細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損,NSE透過血腦屏障進(jìn)入腦脊液及體循環(huán)[13],這為本研究提供了理論基礎(chǔ)。外源性GM1已被用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,但應(yīng)用于膽紅素腦病的研究尚少[4]。本研究通過建立新生7日齡高膽紅素血癥大鼠模型,隨時(shí)間推移,腦組織海馬區(qū)細(xì)胞排列愈加紊亂、水腫明顯、凋亡增加,血清NSE水平增加,提示膽紅素所致腦損傷,予以外源性GM1干預(yù)后海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少、血清NSE含量降低,初步推斷在高膽紅素血癥中,GM1也發(fā)揮著腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上,此實(shí)驗(yàn)觀察到新生高膽紅素血癥SD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加,血清NSE水平明顯升高,GM1干預(yù)后細(xì)胞凋亡減少,NSE水平下降,認(rèn)為GM1對新生高膽紅素血癥大鼠腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用,這為實(shí)際工作中早期防治高膽紅素血癥腦損傷提供了新的治療思路。有研究顯示[17],維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是神經(jīng)元存活的關(guān)鍵,那么GM1是如何調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)起到神經(jīng)保護(hù)作用,其中涉及的詳細(xì)分子機(jī)制還需大量的實(shí)驗(yàn)研究。