鐘毅征,林 靜,謝蓬蓬,陳晶晶,何浪弛,劉 丹,梁秋芬

(1廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中醫(yī)婦科,廣州 510000;2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科;*通訊作者,E-mail:yzz0114@163.com)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種女性特發(fā)的內(nèi)分泌紊亂性疾病,以卵巢的多囊性改變?yōu)橹饕卣?可導(dǎo)致患者排卵減少或不排卵、不孕、月經(jīng)不調(diào)、肥胖等,不僅危害女性生殖功能,還會(huì)增加腫瘤產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)[1,2]。炎癥和自噬是PCOS發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié),研究顯示,PCOS患者體內(nèi)抗炎因子水平明顯減少,自噬活性降低,通過抑制炎癥、增強(qiáng)自噬可改善PCOS引發(fā)的卵泡過度激活和生長等癥狀[3,4]。針刺是一種廣泛應(yīng)用于臨床的中醫(yī)療法,可有效減輕PCOS患者體內(nèi)炎癥,改善其胰島素抵抗,進(jìn)而修復(fù)卵巢正常排卵功能[5],還可通過抑制mTOR信號促進(jìn)自噬,減輕PCOS大鼠線粒體功能障礙及高雄激素血癥[6],對PCOS起到很強(qiáng)的治療功效,但其確切的作用機(jī)制目前尚未有明確闡述。

蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是調(diào)控炎癥和自噬作用的重要信號,在PCOS的發(fā)生及病情進(jìn)展過程中起到關(guān)鍵作用,抑制AKT/mTOR激活,可增強(qiáng)自噬,阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展,改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸損傷[7],還可抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖,減輕PCOS大鼠卵巢多囊性病理改變[8]。lncRNA MEG3是一種可介導(dǎo)自噬過程的長鏈非編碼RNA[9],在對膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)lncRNA MEG3,可抑制PI3K/AKT/mTOR通路蛋白磷酸化,促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬[10],因而推測通過上調(diào)lncRNA MEG3抑制AKT/mTOR信號,進(jìn)而增強(qiáng)自噬,可能是針刺治療PCOS的作用機(jī)制。本研究通過建立PCOS大鼠模型,對此進(jìn)行探討驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠,7～8周齡,體質(zhì)量180～220 g,SPF級,購自廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK(桂)2018-0002,廣西中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物房中適應(yīng)分籠飼養(yǎng),每籠4～6只大鼠,溫度設(shè)為23～25.5 ℃,相對濕度設(shè)為52%～60%,每天通風(fēng)換氣13～18次。

1.2 主要試劑

來曲唑(純度:HPLC≥98%)、羧甲基纖維素鈉,北京索萊寶科技有限公司;腺病毒包裝的lncRNA MEG3 siRNA及其陰性對照、lncRNA MEG3與β-actin引物、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒、大鼠促黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒、睪酮(T)ELISA試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;RNAiso Plus,日本TaKaRa公司;血清活性氧(ROS)測定試劑盒,北京百奧萊博科技有限公司;IL-17測試盒、IL-18測試盒、高強(qiáng)度RIPA裂解液,南京建成生物工程研究所;BCA蛋白檢測試劑盒、兔源anti-Beclin1一抗、羊抗兔二抗、兔源anti-p-AKT一抗、兔源anti-β-actin一抗、兔源anti-mTOR一抗、兔源Anti-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)一抗、HE染色試劑盒、兔源anti-AKT、兔源anti-p-mTOR一抗,美國Abcam公司。

1.3 主要儀器

KWD-808-Ⅰ型脈沖針灸治療儀,常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司;Biotek aQuant型酶標(biāo)儀,上海坤肯生物化工有限公司;LEIKA-RM2135型病理切片機(jī)、DM4000 B LED型顯微鏡,德國Leika公司;Tissue-Tek VIP6型全自動(dòng)脫水機(jī),日本櫻花公司;Y6-6LF型生物組織包埋機(jī),湖北亞光易用電子技術(shù)有限公司;Stepone plus型熒光定量PCR儀,美國ABI公司;L00686C型快速智能蛋白濕轉(zhuǎn)儀,南京金斯瑞生物科技有限公司;Tanon 4600型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)、EPS300型電泳儀,上海天能科技有限公司。

1.4 PCOS大鼠模型制備及分組處理

參照文獻(xiàn)[11,12]中方法:以高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠12周,并于第3周開始每日灌胃來曲唑(溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)1次,劑量為1 mg/kg,共灌胃9周,然后檢測發(fā)現(xiàn)血清T、LH水平顯著升高,表示造模成功,將其隨機(jī)分為5組:模型組、針刺組、lncRNA MEG3 siRNA組、lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組、針刺+lncRNA MEG3 siRNA組,每組12只;另取12只大鼠喂養(yǎng)高脂飼料并灌胃等劑量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,設(shè)為對照組。

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位雙側(cè)“帶脈”,參照文獻(xiàn)[13]避光固定大鼠,電針儀直接對其進(jìn)行針刺20 min,電針強(qiáng)度0.6～1.4 mA,頻率2 Hz/100 Hz,每日針刺1次,連續(xù)針刺治療14 d;lncRNA MEG3 siRNA組、lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組、針刺+lncRNA MEG3 siRNA組靜脈注射腺病毒包裝的lncRNA MEG3 siRNA及其陰性對照(劑量均為1×1011PFU),每周1次,共注射2周,對照組、模型組和針刺組大鼠每周靜脈注射等量生理鹽水1次,共注射2周。

1.5 大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量測定及標(biāo)本采集

第14次針刺干預(yù)結(jié)束后24 h,麻醉大鼠(吸入乙醚)后稱量其體質(zhì)量,采集腹主動(dòng)脈血,靜置離心,吸出上清(血清)保存于-80 ℃。處死大鼠,開腹取出卵巢,稱其質(zhì)量,然后以小剪刀取下0.4 g保存于液氮;再次取下0.5 g,剪碎、勻漿、離心,以試劑盒通過BCA法測得上清中蛋白總濃度,分組標(biāo)記后保存于-80 ℃;剩余卵巢進(jìn)行固定、脫水、包埋后進(jìn)行常規(guī)病理切片備用。

1.6 ELISA及熒光探針法分別測定大鼠血清T、LH、IL-17、IL-18、ROS水平

以冰水浴緩慢解凍1.4中血清,采用試劑盒嚴(yán)格按照各組說明書指導(dǎo)操作步驟:取96孔板包被后,封閉、加樣、孵育酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng),采用酶標(biāo)儀測出各孔吸光度后,計(jì)算出其中T、LH、IL-17、IL-18水平;通過熒光探針法測定ROS水平:取96孔板中依次滴加100 μl新鮮血清樣本、10 μl熒光探針,混勻后37 ℃避光孵育30 min,采用酶標(biāo)儀測出各孔熒光強(qiáng)度,計(jì)算出其中ROS水平。

1.7 HE染色觀察大鼠卵巢形態(tài)

以二甲苯對1.4中的卵巢組織切片做脫蠟處理,水化后進(jìn)行HE染色,嚴(yán)格按照各組說明書指導(dǎo)操作,隨機(jī)選出200倍顯微鏡下5個(gè)視野拍照,并采用病理分析軟件Image J分析計(jì)數(shù)每個(gè)視野中卵泡數(shù)量,取平均值。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠卵巢組織lncRNA MEG3表達(dá)

以RNAiso Plus提取1.4中卵巢組織總RNA,并用試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系配制及實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定均參照試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行,具體反應(yīng)條件為:反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 5 min;預(yù)變性95 ℃ 3 min;PCR反應(yīng)95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),以β-actin作為lncRNA MEG3的內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt算法對所得Ct值進(jìn)行分析,得出lncRNA MEG3的相對表達(dá),引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 免疫印跡法檢測大鼠卵巢組織自噬相關(guān)蛋白及AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取出1.2.2中卵巢組織蛋白樣品液,每組取20 μg蛋白變性,電泳分離蛋白后,接著濕轉(zhuǎn),膜上蛋白經(jīng)封閉后,分別孵育Beclin-1、β-actin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、LC3一抗(稀釋比例均為1 ∶2 000),然后孵育二抗(稀釋比例為1 ∶1 000),化學(xué)發(fā)光法顯色,采集蛋白條帶圖像并用Image J軟件定量其灰度值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后得到各蛋白相對表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均是計(jì)量資料,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并運(yùn)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MEG3對大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量的影響

與對照組比較,模型組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量均明顯升高(P<0.05,見表2)。與模型組比較,針刺組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量均降低(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量均升高(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量無明顯變化(P>0.05,見表2)。與針刺組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量均升高(P<0.05)。與lncRNA MEG3 siRNA組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量均降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量

2.2 lncRNA MEG3對大鼠性激素水平的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清中T、LH水平均明顯升高(P<0.05,見表3)。與模型組比較,針刺組大鼠血清中T、LH水平均降低(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA組大鼠血清中T、LH水平均升高(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組大鼠血清中T、LH水平無明顯變化(P>0.05,見表3)。與針刺組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠血清中T、LH水平均升高(P<0.05)。與lncRNA MEG3 siRNA組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠血清中T、LH水平均降低(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠血清中T、LH水平

2.3 lncRNA MEG3對大鼠囊狀卵泡數(shù)量的影響

與對照組比較,模型組大鼠囊狀卵泡數(shù)量明顯升高(18.64±4.32vs0.75±0.24,P<0.05,見圖1)。與模型組比較,針刺組大鼠囊狀卵泡數(shù)量降低(1.46±0.58vs18.64±4.32,P<0.05);lncRNA MEG3 siRNA組大鼠囊狀卵泡數(shù)量升高(29.36±5.21vs18.64±4.32,P<0.05);lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組大鼠囊狀卵泡數(shù)量無明顯變化(18.95±4.73vs18.64±4.32,P>0.05)。與針刺組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠囊狀卵泡數(shù)量升高(17.48±4.15vs1.46±0.58,P<0.05,見圖1)。與lncRNA MEG3 siRNA組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠囊狀卵泡數(shù)量降低(17.48±4.15vs29.36±5.21,P<0.05,見圖1)。

黑色箭頭表示卵泡圖1 各組大鼠卵巢形態(tài)的HE染色結(jié)果 (×200)Figure 1 Morphology of ovarian in rats in each group by HE staining (×200)

2.4 lncRNA MEG3對大鼠血清炎性介質(zhì)水平的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-17、IL-18及ROS水平明顯升高(P<0.05,見表4)。與模型組比較,針刺組大鼠血清IL-17、IL-18及ROS水平均降低(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA組大鼠血清IL-17、IL-18及ROS水平均升高(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組大鼠血清IL-17、IL-18及ROS水平無明顯變化(P>0.05,見表4)。與針刺組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠血清IL-17、IL-18及ROS水平均升高(P<0.05)。與lncRNA MEG3 siRNA組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠血清IL-17、IL-18及ROS水平均降低(P<0.05,見表4)。

表4 各組大鼠血清IL-17、IL-1β及TNF-α水平

2.5 lncRNA MEG3對大鼠卵巢組織自噬相關(guān)蛋白的影響

與對照組比較,模型組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,見圖2、表5)。與模型組比較,針刺組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05),lncRNAMEG3 siRNA陰性對照組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05,見圖2、表5)。與針刺組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與lncRNA MEG3 siRNA組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05,見圖2、表5)。

圖2 免疫印跡檢測各組大鼠卵巢組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of autophagy-associated protein in ovarian tissue of rats in each group detected by Western blot

表5 各組大鼠卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達(dá)水平

2.6 各組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3及AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果

與對照組比較,模型組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平明顯降低(P<0.05),AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平明顯升高(P<0.05,見圖3、表6)。與模型組比較,針刺組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平均升高(P<0.05),AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平均降低(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平均降低(P<0.05),AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平均升高(P<0.05),lncRNA MEG3 siRNA陰性對照組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平與AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平無明顯變化(P>0.05,見圖3、表6)。與針刺組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平降低(P<0.05),AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平升高(P<0.05)。與lncRNA MEG3 siRNA組比較,針刺+lncRNA MEG3 siRNA組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平升高(P<0.05),AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平降低(P<0.05,見圖3、表6)。

圖3 免疫印跡檢測各組大鼠卵巢組織AKT/mTOR通路蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of AKT/mTOR pathway proteins in ovarian tissue of rats in each group detected by Western blot

表6 各組大鼠卵巢組織lncRNA MEG3及AKT/mTOR通路蛋白相對表達(dá)水平

3 討論

PCOS嚴(yán)重影響女性的生殖健康和生活質(zhì)量,目前臨床以藥物治療為主,主要包括調(diào)經(jīng)藥、胰島素增敏藥、雄激素抑制藥和促排卵藥,但長期服用會(huì)出現(xiàn)副作用和不良反應(yīng),因此積極探尋更好的治療藥物是臨床亟待解決的難點(diǎn)[1,2,14]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飼料喂養(yǎng)并灌胃來曲唑的方法制備PCOS大鼠模型,結(jié)果顯示,建模大鼠血清T、LH、IL-17、IL-18及ROS水平顯著升高,顯示大鼠性激素水平分泌異常,體內(nèi)產(chǎn)生明顯炎癥,引起大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量顯著提高,促使囊狀卵泡產(chǎn)生,表明大鼠產(chǎn)生PCOS樣癥狀,建模成功。

自噬作用和炎癥反應(yīng)在PCOS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,通過促進(jìn)自噬,并進(jìn)行抗炎治療,可有效減輕PCOS排卵功能障礙和卵巢雄激素分泌過多等臨床癥狀[3,4,15]。研究顯示,針刺在PCOS的臨床治療中有廣泛應(yīng)用,可恢復(fù)PCOS大鼠動(dòng)情周期,降低大鼠體內(nèi)炎癥水平,減輕其性激素水平分泌異常[16,17],并可通過增強(qiáng)自噬改善PCOS癥狀[6],本實(shí)驗(yàn)以針刺干預(yù)處理PCOS大鼠,可顯著降低大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、血清T、LH、IL-17、IL-18及ROS水平、囊狀卵泡數(shù)量,并升高卵巢組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平,表明針刺干預(yù)可有效降低PCOS大鼠體內(nèi)炎性因子水平,促進(jìn)自噬,減少囊狀卵泡生成,改善大鼠肥胖及性激素水平分泌異常,與上述研究結(jié)果[6,16,17]相似,均證實(shí)了針刺可通過抑制炎癥,增強(qiáng)自噬來治療PCOS。

AKT/mTOR是重要的自噬及炎癥調(diào)控信號,參與介導(dǎo)結(jié)腸炎[7]、肺損傷[18]、PCOS等疾病的發(fā)病及病情進(jìn)展過程,下調(diào)AKT/mTOR通路可增強(qiáng)自噬活性,修復(fù)卵巢功能,改善PCOS臨床癥狀[8,19]。另有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3可通過抑制Akt/mTOR途徑激活促進(jìn)神經(jīng)元自噬,且針刺可通過抑制mTOR信號增強(qiáng)自噬[6,20],因而推測針刺可能通過lncRNA MEG3抑制AKT/mTOR信號,進(jìn)而增強(qiáng)自噬,最終達(dá)到治療PCOS的功效。本研究結(jié)果顯示,PCOS大鼠卵巢組織lncRNA MEG3水平、Beclin-1與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平升高,而針刺治療可減輕上述變化趨勢,且lncRNA MEG3 siRNA起到相反作用,并加重PCOS大鼠肥胖、性激素分泌異常、多囊狀卵泡等臨床癥狀,表明lncRNA MEG3可調(diào)控AKT/mTOR信號,并介導(dǎo)針刺對PCOS的治療過程。另外以lncRNA MEG3 siRNA處理PCOS大鼠同時(shí)進(jìn)行針刺治療,可減弱針刺干預(yù)對炎癥及肥胖、性激素分泌異常、多囊狀卵泡等臨床癥狀的緩解作用,拮抗其對大鼠卵巢功能的修復(fù)作用,最終逆轉(zhuǎn)針刺對PCOS大鼠的治療作用,表明針刺治療可通過促進(jìn)lncRNA MEG3表達(dá),抑制AKT/mTOR信號激活,進(jìn)而增強(qiáng)自噬活性,抑制炎癥,對PCOS發(fā)揮治療作用。

綜上所述,針刺可通過上調(diào)lncRNA MEG3,降低AKT/mTOR通路蛋白的磷酸化水平,促進(jìn)自噬,抑制炎癥產(chǎn)生及進(jìn)展,改善PCOS大鼠性激素分泌異常,減輕大鼠體質(zhì)量,減少囊狀卵泡形成,有效改善大鼠PCOS樣臨床癥狀,通過lncRNA MEG3調(diào)控AKT/mTOR介導(dǎo)的自噬途徑是其作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)為針刺治療PCOS的臨床推廣提供了新的科學(xué)支持,對提高女性生殖健康水平有積極意義。