張 彤,周 妍,吳 巍

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系,北京 100069;*通訊作者,E-mail:weiwu207@ccmu.edu.cn)

蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是一種從十字花科植物中提取具有抗癌潛力的化合物[1]。研究表明,在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,SFN能觸發(fā)微管斷裂,抑制自噬溶酶體的形成導致細胞凋亡,但SFN抑制自噬溶酶體形成的機制尚未明確[2]。

研究表明,自噬參與囊泡的形成、運輸和融合,而膜轉運蛋白作為介導溶質、離子或藥物跨生物膜選擇性轉運的重要跨膜蛋白,與囊泡運輸和融合密切相關[3]。其中,RAB7蛋白作為轉運蛋白,在細胞內的準確定位決定其所介導的囊泡能否正確抵達目的細胞器。RAB7交互溶酶體蛋白(RILP)是RAB7蛋白下游的效應蛋白,定位在溶酶體[4]。RAB7與GTP結合將RILP運送到細胞膜中,共同控制晚期內體和溶酶體的轉運[5,6]。

溶酶體的功能與溶酶體膜蛋白有著密切的關系。其中,ATP6V0D1為溶酶體膜蛋白,具有質子泵的作用,為溶酶體水解酶提供酸性環(huán)境,影響溶酶體功能進而調控自噬途徑[7]。我們推測,SFN通過調控RILP及溶酶體膜蛋白ATP6V0D1抑制自噬溶酶體的形成。本研究通過生物信息學結合免疫熒光染色及蛋白免疫印跡技術研究SFN對RILP及ATP6V0D1的調控作用,探討在非小細胞肺癌中SFN抑制自噬溶酶體形成的分子機制,以便為腫瘤靶向治療提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人非小細胞肺癌細胞株A549細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心;SFN購自美國Santa Cruz公司,β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;RILP抗體、LAMP1抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 激光掃描共聚焦顯微鏡分析

將處于對數生長期的A549細胞接種于免疫熒光專用的共聚焦小皿內。待共聚焦小皿中A549細胞密度達到60%左右后,棄去舊培養(yǎng)基,置換成新鮮的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,對照組不做任何處理,實驗組加入SFN,使其終濃度為20 μmol/L,誘導細胞24 h。棄去舊培養(yǎng)基,經固定、透化、封閉操作后,根據實驗要求將抗RILP抗體(1 ∶200)、抗LAMP1抗體(1 ∶200)加入共聚焦小皿在4 ℃冰箱靜置孵育過夜。隨后加入二抗室溫避光孵育1 h,然后滴加三到四滴含DAPI的防熒光淬滅封片劑封片,于濕潤避光處保存。在激光掃描共聚焦顯微鏡下隨機尋找視野觀察目的蛋白的熒光強度及定位,并拍照。

1.3 高效液相色譜與質譜聯用分析蛋白表達差異

用高效液相色譜和質譜聯用分析SFN處理后肺腺癌細胞A549中蛋白差異表達。將肺腺癌A549分為SFN組與未處理組(對照組)。使用20 μmol/L SFN處理肺腺癌細胞A549 24 h,收集細胞裂解液并定量。對照組與SFN組使用等量的蛋白上樣,每組樣品有3個重復樣本。通過Orbitrap Fusion Lumos質譜儀和EASY-nLC 1000液相色譜系統進行色譜分離和分析,該系統配備了電噴霧電離源。使用C18(1.9 μm,100 A)毛細管柱,流動相為0.1%甲酸/水和0.1%甲酸/乙腈進行分離,并以正電離模式進行檢測。收集數據后,通過Uniprot網站分析蛋白質的細胞定位和功能。

1.4 蛋白免疫印跡技術檢測RILP蛋白的表達

分別加入0,10,20,30 μmol/L SFN處理A549細胞24 h后,使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(Thermo Fisher Scientific,USA)裂解細胞,通過12% SDS-PAGE電泳分離對應樣品中等量的蛋白質分子(20 μg),根據目的蛋白分子量觀察對應蛋白Marker的分離情況,一般在溴酚藍到達分離膠底部時轉膜,最后使用Odyssey Software Version啟動成像系統檢測不同濃度SFN處理后RILP(1 ∶1 000),β-actin(1 ∶5 000)蛋白的表達。

1.5 生物信息學分析

使用UALCAN數據庫分析肺癌與癌旁組織蛋白差異表達;用ONCOLNC數據庫分析肺癌患者中RILP、ATP6V0D1蛋白表達與生存期的關聯;用STRING數據庫(10.5版)來分析RILP與微管蛋白TUBB/TUBA1A、LC3Ⅱ之間的相互作用;用GEPIA數據庫分析RILP、ATP6V0D1、LC3Ⅱ蛋白間的相關性。

1.6 數據處理和統計學檢驗

2 結果

2.1 SFN誘導溶酶體核周聚集

免疫共聚焦熒光顯微鏡觀察顯示:對照組溶酶體散在、均一分于細胞質中;SFN組SFN處理細胞后溶酶體團成一簇聚集在核周(見圖1)。

紅色熒光表示溶酶體相關膜蛋白LAMP1;藍色熒光表示細胞核染料DAPI圖1 SFN對溶酶體核周聚集的影響Figure 1 Effect of SFN on the perinuclear aggregation of lysosomes

2.2 SFN誘導上調的蛋白富集到膜轉運相關通路

液相色譜和質譜聯用分析表明:在SFN處理的A549細胞中,380個蛋白表達上調(紅色),同時278個蛋白表達下調(綠色),差異有統計學意義(P<0.05,見圖2A);利用Uniprot網站預測這些差異蛋白的功能與亞細胞定位,同時對上調的蛋白進行聚類分析發(fā)現SFN處理后蛋白富集到膜轉運相關通路(見圖2B)。

A.火山圖分析蛋白表達差異 B.Uniprot網站中蛋白聚類分析圖2 液相色譜和質譜聯用分析差異蛋白的功能Figure 2 Function of differential proteins by liquid chromatography and mass spectrometry

2.3 SFN上調RILP及RILP與微管蛋白的相互作用

使用蛋白免疫印跡技術檢測SFN處理A549細胞后RILP蛋白的表達情況,發(fā)現隨著SFN濃度的升高RILP的表達水平逐漸上升,差異有統計學意義(P<0.05,見圖3A),表明SFN對RILP表達的調節(jié)呈濃度依賴性。同時該蛋白與微管蛋白TUBB/TUBA1A有相互作用(見圖3B)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05B.STRING數據庫中PPI網絡分析A.SFN上調A549細胞中RILP蛋白表達圖3 SFN處理后RILP的表達及RILP與TUBB/TUBA1A蛋白表達關聯Figure 3 The expression of RILP after SFN treatment and the association of RILP with TUBB/TUBA1A protein

2.4 RILP的表達與肺癌患者生存率有相關性

TCGA數據分析顯示RILP在肺腺癌和肺鱗癌組織中較正常組織表達顯著降低(P<0.05,見圖4A)。且ONCOLNC數據庫顯示高表達RILP的肺癌患者生存率高(P<0.05,見圖4B)。

A.TCGA數據庫中RILP蛋白的表達B.ONCOLNC數據庫中NSCLC患者生存曲線分析圖4 RILP在肺癌中的表達及RILP蛋白高表達的肺癌患者生存曲線Figure 4 The expression of RILP in lung cancer and the survival curve of lung cancer patients with high RILP expression

2.5 RILP與自噬相關蛋白LC3Ⅱ的相關性

STRING數據庫顯示,RILP與自噬相關蛋白LC3Ⅱ(基因名:MAP1LC3B)存在相互作用(見圖5A),TCGA數據庫分析顯示在肺鱗癌與肺腺癌中RILP與LC3Ⅱ的表達呈正相關(肺腺癌:r=0.20,P<0.01;肺鱗癌:r=0.37,P<0.01,見圖5B)。

2.6 肺癌中RILP與ATP6V0D1的相關性

TCGA數據庫顯示在肺鱗癌和肺腺癌中RILP與ATP6V0D1呈正相關(肺腺癌:r=0.37,P<0.01;肺鱗癌:r=0.54,P<0.01,見圖6)。

2.7 ATP6V0D1上調自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達

ONCOLNC數據庫顯示ATP6V0D1在肺腺癌和肺鱗癌中表達較正常組織顯著降低(P<0.05),且ONCOLNC數據庫顯示ATP6V0D1高表達的患者生存率顯著提高(P<0.05,見圖7)。

A.STRING數據庫中PPI網絡分析B.TCGA數據庫中基因相關性分析圖5 肺癌患者中RILP與LC3Ⅱ的相關性分析Figure 5 Correlation between RILP and LC3Ⅱ in lung carcinoma patients

A.肺腺癌B.肺鱗癌圖6 TCGA數據庫分析RILP與ATP6V0D1在肺腺癌和肺鱗癌中的相關性Figure 6 Correlation between RILP and ATP6V0D1 in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma by TCGA database

B.ONCOLNC數據庫中NSCLC患者生存曲線分析A.TCGA數據庫中ATP6V0D1蛋白表達分析圖7 ATP6V0D1在肺癌的表達及ATP6V0D1高表達的肺癌患者生存曲線Figure 7 The expression of ATP6V0D1 in lung cancer and the survival curve of lung cancer patients with high ATP6V0D1 expression

2.8 肺癌中ATP6V0D1與自噬相關蛋白LC3Ⅱ的相關性

TCGA數據庫顯示在肺鱗癌和肺腺癌中,ATP6V0D1與自噬標志蛋白LC3Ⅱ呈正相關(肺腺癌:r=0.48,P<0.01;肺鱗癌:r=0.57,P<0.01,見圖8)。

A.肺腺癌患者基因相關性分析B.肺鱗癌患者基因相關性分析圖8 TCGA數據庫分析肺腺癌和肺鱗癌患者ATP6V0D1與LC3Ⅱ的相關性分析Figure 8 Correlation between ATP6V0D1 and LC3Ⅱ in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma by TCGA database

3 討論

既往研究發(fā)現SFN是一種有潛力的抗癌活性物質,通過調節(jié)自噬誘導凋亡并能抑制多種腫瘤細胞增殖、浸潤[8]。本研究我們進一步發(fā)現SFN可以上調RILP的表達,增強RILP與溶酶體ATP6V0D1蛋白及LC3Ⅱ的關聯,從而抑制非小細胞肺癌細胞自噬體與溶酶體融合。這些研究結果對于我們分析SFN調節(jié)的自噬機制及其潛在的抗癌靶點提供了新的思路。

自噬是一種重要的細胞降解過程,其中功能失調的細胞質內容物被溶酶體水解酶消化。在自噬過程中,伴隨著一些囊泡的融合,包括自噬體和溶酶體的融合,導致自噬溶酶體中的內容物降解和清除[9]。實驗室前期結果顯示,SFN及其代謝物可以誘導腫瘤細胞形成自噬體,同時抑制自噬體與溶酶體的融合,阻礙腫瘤細胞內的錯誤折疊蛋白和受損細胞器的降解,從而誘導腫瘤細胞凋亡[10]。

RILP蛋白作為溶酶體膜蛋白,通過與其上游蛋白RAB7相互作用,調節(jié)核內體和溶酶體之間的信號轉導并參與自噬小體的成熟,同時有文獻報道其在自噬溶酶體形成中也扮演著至關重要的作用[11]。生物信息學分析顯示RILP高表達的肺癌患者生存率顯著升高,這意味著RILP是一個抑癌蛋白,上調RILP可能成為治療肺癌的新方向。蛋白免疫印跡結果顯示:SFN上調RILP蛋白的表達;同時免疫熒光實驗發(fā)現SFN誘導溶酶體在核周聚集,這提示我們在非小細胞肺癌細胞中,SFN可能通過調節(jié)RILP蛋白誘導溶酶體向核周聚集。研究表明,SFN靶向細胞中多種蛋白,其中以α-tubulin蛋白為主。SFN可以與α-tubulin共價結合,破壞其二級和三級結構,抑制微管聚合,從而誘導腫瘤細胞凋亡[12]。為了研究RILP蛋白與自噬之間的關聯,我們使用TCGA數據庫分析RILP蛋白與自噬相關蛋白LC3Ⅱ的關系,發(fā)現RILP蛋白可與LC3Ⅱ、tubulin相互作用,這進一步證明在非小細胞肺癌中,RILP蛋白能夠調控自噬溶酶體形成,并且微管蛋白tubulin可能調控RILP蛋白介導的自噬。

溶酶體作為細胞內的“清道夫”,可以與自噬體融合,從而消化細胞內受損的細胞器,與溶酶體膜上蛋白質復合體V-ATPase密切相關。研究發(fā)現,V-ATPase具有質子泵的活性,能為溶酶體水解酶提供酸性環(huán)境,從而維持溶酶體正常功能[13]。有文獻報道RILP可以通過調控V-ATPase進而影響溶酶體的功能,而ATP6V0D1作為V-ATPase中的一種亞基,在膜轉運以及膜融合方面扮演著重要的角色[14,15]。生物信息學分析顯示ATP6V0D1與LC3Ⅱ在肺腺癌和肺鱗癌的表達均呈正相關,LC3Ⅱ蛋白作為一種微管相關蛋白,主要存在于自噬體膜上,并在自噬溶酶體的形成中發(fā)揮作用,這提示我們ATP6V0D1在自噬溶酶體形成中也扮演著重要的角色。同時,ATP6V0D1高表達的肺癌患者生存率顯著升高,這表明ATP6V0D1是一個抑癌蛋白,可能成為治療肺癌的新靶點。

綜上所述,我們證明SFN在亞細胞水平抑制自噬溶酶體形成的機制,這些結果可以為開發(fā)新的抗癌療法提供理論支持。