韓士舉,林 強(qiáng),孟憲博,趙亞剛,王景杰

(空軍軍醫(yī)大學(xué)大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jingjiefmmu@163.com)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是指胃、十二指腸內(nèi)容物逆流進(jìn)入食管引發(fā)的以燒心、反流為典型癥狀的慢性疾病,同時可伴有胸痛、咽喉不適、哮喘及咳嗽等食管外癥狀,依內(nèi)鏡下表現(xiàn)主要分為反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)和非腐蝕性反流性疾病(nonerosive reflux disease,NERD)兩種表型[1],GERD在世界范圍內(nèi)廣泛流行,我國人群的GERD患病率高達(dá)7.69%[2],該病癥狀易反復(fù)發(fā)作,不僅影響患者的身心健康和生活質(zhì)量,給社會也帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān),其治療是目前臨床工作的難點和挑戰(zhàn)。目前雖然其治療手段多樣,但“質(zhì)子泵抑制劑治療無效”及“心身共病”這兩大難治性GERD的診療難題仍未得到有效解決,臨床上對GERD伴發(fā)精神心理障礙患者的處置尤為棘手。有研究發(fā)現(xiàn)對GERD與精神心理障礙心身共病的患者進(jìn)行質(zhì)子泵抑制劑及抗反流手術(shù)治療,患者癥狀緩解并不明顯,即使加用抗焦慮抑郁等精神類藥品只能減輕患者精神癥狀而加重反流癥狀[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在GERD和精神心理障礙發(fā)病中分別發(fā)揮著重要作用[4,5],然而GERD與精神心理障礙身心共病患者腸道菌群改變情況目前尚不清楚,本研究旨在探討GERD伴焦慮抑郁身心共病患者腸道菌群改變情況,為GERD與精神心理障礙心身共病的患者尋找有效治療手段提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月至2021年10月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科內(nèi)鏡中心診斷為GERD的58例患者,包括GERD伴焦慮抑郁患者27例以及GERD不伴焦慮抑郁患者31例,同期隨機(jī)選取健康體檢中心40例健康志愿者,收集并整理患者的基本信息如吸煙史、飲酒史、家族史等,并根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為:正常對照(NC)組、GERD不伴焦慮抑郁(GNAD)組、GERD伴焦慮抑郁(GAD)組。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

GERD患者納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～70歲之間;②內(nèi)鏡明確診斷為反流性食管炎患者;內(nèi)鏡陰性,但經(jīng)24 h動態(tài)反流監(jiān)測診斷為GERD患者;③近2周內(nèi)未服用PPI、抗生素、益生元或益生菌等;④簽署知情同意書并同意取糞便進(jìn)行菌群分析;⑤依據(jù)焦慮自評表(SAS)及抑郁自評量表(SDS)的測評結(jié)果將GERD患者分別分入GAD及GNAD兩組。

正常對照組納入標(biāo)準(zhǔn):①健康體檢中心提供年齡在18～70歲之間無器質(zhì)性疾病人群,經(jīng)過內(nèi)鏡檢查無反流性食管炎,GredQ評分<8分,SAS、SDS評分量表診斷無焦慮或抑郁;②近2周內(nèi)未服用PPI、抗生素、益生元或益生菌等;③愿意提供糞便樣本進(jìn)行菌群分析。

排除標(biāo)準(zhǔn):①全身疾病史,例如肝硬化、腎衰竭和惡性腫瘤;②相關(guān)檢查除外胃腸道器質(zhì)性病變;③無法完成問卷調(diào)查或者其他相關(guān)檢查患者排除在外。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 利用小匙取1 g大便樣本裝至1.8 ml凍存管,獲取新鮮樣本后2～6 h內(nèi)冰袋轉(zhuǎn)運至我院消化內(nèi)科實驗室-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二代測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾,然后進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類分析和物種分類學(xué)分析。

1.3.2 糞便菌群DNA提取 使用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取糞便總DNA,瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性, Qubit定量檢測DNA樣本濃度。

1.3.3 16S rRNA PCR擴(kuò)增、Illumina測序及文庫質(zhì)控 對質(zhì)檢合格的DNA使用Nobar-341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)及Nobar-805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)正反測序引物,PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3和V4區(qū)。

通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小獲得點樣順序,使用Qubit3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定得到均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。本研究基于Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行上機(jī)測序。采用PANDAseq軟件通過重疊關(guān)系進(jìn)行拼接,獲得高變區(qū)的長reads(序列)。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共27例GAD患者、31例GNAD患者和40例NC入選本研究。27例GAD者中,RE患者17例,NERD患者10例;31例GNAD患者中,RE患者22例,NERD患者9例。在基線比較中,三組人員的性別構(gòu)成比、年齡及體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

2.2 糞便菌群總體特征分析

2.2.1 OTU數(shù)目 本研究共得到493個OTUs,基于不同樣本和不同組之間的OTUs數(shù)目繪制Venn圖(見圖1),GAD組、GNAD和NC組的OTUs數(shù)目分別為453個、402個及419個,共有的OTUs數(shù)目為351個;Observed OTU指數(shù)代表菌群中的OTU豐度大于0物種數(shù)之和,三組之間的Observed OTU指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.3,見圖2),表明三組在OTU多樣性比較上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 GAD、GNAD及NC三組研究對象之間的基線值比較

圖1 GAD、GNAD及NC三組OTUs數(shù)目Venn圖Figure 1 Venn diagram of OTUs in GAD, GNAD and NC groups

圖2 GAD、GNAD及NC三組之間的OTU多樣性比較Figure 2 Comparison of OTU diversity among GAD, GNAD and NC groups

2.2.2 糞便相關(guān)菌群物種注釋分析 本研究根據(jù)物種注釋結(jié)果分別在門、綱、目、科、屬水平確定了糞便細(xì)菌群落相對豐度排名。其中在門水平,排名靠前的是厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門及其他;在綱水平,物種豐度較高的是梭菌綱、γ-變形菌綱、放線菌綱、厚壁菌綱;在目水平,梭菌目、腸桿菌目、雙歧桿菌目、乳桿菌目在三組的豐度均靠前;在科水平,豐度較高的包括瘤胃菌科、腸桿菌科、雙歧桿菌科、毛螺旋菌科、丹毒絲菌科、擬桿菌科、鏈球菌科、明串珠菌科、乳桿菌科、紅蝽桿菌科、消化鏈球菌科、巴斯德菌科、普氏菌科;在屬層面上,芽殖菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬、羅斯氏菌屬、柯林斯氏菌屬、小球菌屬等占優(yōu)勢(見圖3)。

2.3 組間Alpha多樣性分析

采用ANOVA方差分析檢驗三組腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)差異,豐富度用chao指數(shù)表示,多樣性則采用香濃(Shannon)指數(shù)和辛普森(Simpson)指數(shù)2個指標(biāo)表示,樣本文庫覆蓋率用測序深度(Coverage)指數(shù)表示。最終結(jié)果顯示,三組之間的chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.21,0.64,0.82,0.61,見圖4)。

2.4 組間物種差異性分析

利用Welch’st檢驗對不同組在不同水平的腸道菌群豐度進(jìn)行兩兩比較時發(fā)現(xiàn),在科水平GAD組的莫拉氏菌科及Incertae-Sedis-ⅩⅢ科的相對豐度水平高于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在屬水平GAD組的不動桿菌屬、沉積物桿菌屬、木桿菌屬、根瘤菌屬、毛絨厭氧桿菌屬相對豐度高于NC組(P<0.05),GAD組的毛絨厭氧桿菌屬的豐度高于GNAD組(P<0.05);GNAD組厚壁菌門的相對豐度低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

2.5 組間的LEfSe分析

本研究通過LEfSe檢驗確定了對GNAD組貢獻(xiàn)顯著的5個OTU及4個不同水平的細(xì)菌物種(LEfSe檢驗,均P<0.05,見圖6),設(shè)定線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)閾值為2,評估差異顯著的物種的影響力,分值從高到低依次為鏈球菌科、鏈球菌屬、歐陸森氏菌屬、霍爾德曼氏菌屬(見圖7)。

圖3 三組菌群在門、綱、目、科、屬分類水平構(gòu)成及豐度值Figure 3 Relative abundance of species at phylum, class, order, family and genus levels in each group

圖4 GAD、GNAD及NC三組菌群Alpha多樣性比較Figure 4 Comparison of Alpha diversity of bacteria between three groups

與NC組比較，*P<0.05;與GAD組比較，#P<0.05圖5 不同分類水平的菌種差異比較Figure 5 Comparison of different levels between groups

圖6 三組之間糞便菌群LEfSe分析Figure 6 The LEfSe analysis of intestinal flora between three groups

圖7 GAD組腸道菌群LDA評分Figure 7 LDA score of the intestinal flora in GAD patients

3 討論

眾所周知,腸道是人體最大的細(xì)菌庫,菌群紊亂不僅能導(dǎo)致消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生,還可通過腦-腸軸與宿主進(jìn)行互動,影響宿主大腦功能和行為,在焦慮抑郁等精神心理障礙的發(fā)病中起到重要作用。菌群失調(diào)影響GERD的機(jī)制可能包括:①以革蘭氏陰性菌為代表的腸道內(nèi)的部分微生物細(xì)菌可以產(chǎn)生大量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活Toll樣受體-4(Toll-like receptor 4,TLR-4),誘導(dǎo)白介素(interleukin,IL)18的產(chǎn)生,繼而啟動IL和腫瘤壞死因子的級聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)炎癥的發(fā)生并導(dǎo)致內(nèi)臟高敏[4];②另一方面腸道菌群產(chǎn)生的脂多糖還可通過激活核因子-κB(NF-κB)信號通路促進(jìn)環(huán)氧化酶-2(COX-2)生成延遲胃排空,激活Toll樣受體信號通路上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)增加一氧化氮合成使食管下括約肌松弛[6],腸道微生態(tài)紊亂在焦慮抑郁等精神心理障礙的發(fā)生發(fā)展也發(fā)揮了重要作用,腸道菌群借助其代謝產(chǎn)物、炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)、各類激素通過下丘腦-垂體-腎上腺軸、迷走神經(jīng)、血液系統(tǒng)與大腦相應(yīng)功能核團(tuán)互動,影響中樞系統(tǒng)對情感的處理,進(jìn)而導(dǎo)致焦慮抑郁的發(fā)生[7,8]。既往研究也證實GERD及精神心理障礙患者的消化道微生物組成與健康人群相比確實發(fā)生較大改變,在對GERD患者的菌群分析中,菌群的研究范圍從口腔、食管延續(xù)至腸道,結(jié)果均顯示與GERD患者的消化道菌群與健康人群的菌群存在顯著差異[9-11],而在精神心理障礙患者的菌群分析中,研究發(fā)現(xiàn)無論焦慮、抑郁、雙向情感障礙還是精神分裂癥患者與正常人相比腸道菌群均發(fā)生不同層次改變[12-14]。隨著人們腸道微生態(tài)生理學(xué)研究的深入,對這兩類疾病患者腸道菌群針對性治療也取得顯著效果[15,16]。然而針對GERD與精神心理障礙身心共病患者的菌群改變情況的研究目前未見相關(guān)報道,因此我們設(shè)計了本次研究,納入了GERD伴焦慮抑郁、GERD不伴焦慮抑郁及健康人群三類人群進(jìn)行糞便菌群的16SrDNA高通量測序分析,探索GERD與精神心理障礙心神共病患者相對于其他兩組人員腸道菌群的變化特征,以期為基于腸道微生態(tài)的益生菌、益生元及菌群移植治療提供一定思路。

在Alpha多樣性比較上,本研究結(jié)果顯示GERD伴焦慮、抑郁人群與GERD不伴焦慮、抑郁以及健康人群菌群之間的Alpha多樣性無差異。在目前關(guān)于焦慮抑郁患者腸道微生物群變化情況的研究中大多數(shù)病例對照實驗的結(jié)果顯示焦慮抑郁患者與健康對照人群相比Alpha多樣性無差異[17],GERD患者相對于健康人群的Alpha多樣性則傾向于降低[18],本研究納入的三組人群的Alpha多樣性無差異,與目前單純焦慮抑郁患者的菌群多樣性的研究結(jié)果吻合程度更高。

在具體的物種豐度分析時,本文發(fā)現(xiàn)在科水平GERD伴焦慮抑郁組相對于正常人群組的莫拉氏菌及梭狀芽孢桿菌ⅩⅢ豐度明顯升高,在屬水平GERD伴焦慮抑郁患者的的不動桿菌屬、沉積物桿菌屬、木桿菌屬、根瘤菌屬、毛絨厭氧桿菌屬與正常人群相比豐度明顯升高,Jiang等[19]在探索焦慮癥患者腸道菌群變化時發(fā)現(xiàn)焦慮癥患者與健康人相比擬桿菌門、梭桿菌門、糞桿菌屬、直腸真桿菌屬、毛螺菌屬、酪酸球菌屬的豐度升高,Naseribafrouei等[20]發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者相對于健康人群腸道微生物中的顫螺菌屬和產(chǎn)丁酸菌屬的豐度升高,而Chung等[21]的研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的雙歧桿菌屬和布氏桿菌屬的豐度升高,普氏桿菌屬的豐度降低,本次研究結(jié)果與既往研究相比,雖然在具體的菌種存在差異,但總體增加的均為革蘭氏陰性桿菌類。本實驗發(fā)現(xiàn),GERD伴與不伴焦慮抑郁患者在毛絨厭氧桿菌屬的豐度上存在明顯差異,這個發(fā)現(xiàn)目前尚未有報道研究。此外在GERD不伴焦慮、抑郁與健康人群比較時,我們發(fā)現(xiàn)GERD患者人群厚壁菌門的豐度明顯下降,這也與之前報道的研究結(jié)果相吻合[11]?？傮w來看,與既往研究相比，研究中GERD伴發(fā)焦慮、抑郁患者菌種豐度的改變趨勢更接近于單純焦慮抑郁患者的菌種豐度改變趨勢,特別是本實驗GAD組中27例患者中伴焦慮患者19例,占多數(shù),因而菌種豐度分析結(jié)果傾向于既往對焦慮癥患者的菌群分析結(jié)果。

而在三組菌群LEfSe分析中,我們最終確定了鏈球菌科、鏈球菌屬、歐陸森氏菌屬、霍爾德曼氏菌屬與GERD伴焦慮、抑郁密切相關(guān),作者認(rèn)為一方面這4類菌種可能確實參與了GERD伴焦慮、抑郁身心共病的發(fā)病,Zaidi等[22]在GERD的大鼠模型消化道中檢測到高豐度的鏈球菌,Nicolini等[23]發(fā)現(xiàn)早發(fā)性精神障礙患者血清中的抗鏈球菌抗體明顯高于正常人,Cengel-Kultur等[24]也報道了鏈球菌感染與精神癥狀之間存在關(guān)聯(lián),Barandouzi等[25]在抑郁癥患者中發(fā)現(xiàn)歐陸森氏菌屬豐度的升高,Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)霍爾德曼氏菌屬的豐度與焦慮、抑郁呈正相關(guān)。但另一方面也不排除該結(jié)果為患者長期服用PPIs類藥物所致,由于GERD伴發(fā)精神心理障礙患者通常癥狀反復(fù)且難治,因此患者需長時間反復(fù)服用PPIs類藥物來緩解不適,Shi等[27]的研究發(fā)現(xiàn)長期使用PPIs會導(dǎo)致腸道內(nèi)鏈球菌科、韋榮氏球菌科等豐度明顯升高,這與本實驗最終結(jié)果存在一定程度的吻合,盡管本試驗納入的GERD伴焦慮抑郁患者短期內(nèi)未服用PPIs,但在訪談中均有長期反復(fù)服用該類藥物史,因此PPIs仍對本實驗的結(jié)果存在一定程度的干擾。

綜上所述,鏈球菌科、鏈球菌屬、歐陸森氏菌屬、霍爾德曼氏菌屬可能參與GERD伴焦慮、抑郁的發(fā)生發(fā)展,在臨床上有望通過調(diào)節(jié)腸道菌群來預(yù)防和治療該病。但本研究屬于橫斷面研究,難以得出腸道菌群變化與GERD伴焦慮、抑郁的因果關(guān)系,且樣本量較小,可能存在偏倚,需要大樣本、前瞻性研究進(jìn)一步驗證。