聶尊珍,郭 英

(西安大興醫(yī)院病理科,西安 710082;*通訊作者,E-mail:yingguo2nd@aliyun.com)

胃癌是發(fā)病率居世界第5位,死亡率居世界第3位的最常見的惡性腫瘤[1,2]。隨著胃癌早期診斷和治療水平的逐步提高,胃癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)下降的趨勢[3]。部分胃癌具有遺傳背景,約10%的胃癌患者具有家族聚集特征,胃腺癌家族史與胃腺癌發(fā)生的危險度為3.8(95% CI 1.5～9.7)[4]。彌漫型胃癌和印戒細(xì)胞型胃癌,發(fā)生CDH1基因突變與胃癌發(fā)病風(fēng)險高有關(guān)[5],都與胃癌的分子分型密切相關(guān)。胃癌分子分型是實行靶向治療的重要前提。然而目前病理組織形態(tài)學(xué)診斷、免疫組織化學(xué)染色等傳統(tǒng)病理診斷方法,已經(jīng)不能滿足胃癌臨床靶向治療的需求,具有很大局限性。NGS的廣泛應(yīng)用為胃癌基因組的研究開啟了新的視角,可以從基因組層面深入地揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的原因,進而為腫瘤的早期診斷、個性化治療及預(yù)后評估提供有力的理論支撐。因此,如何通過NGS檢測分析、解讀胃癌的病理臨床特征和高頻突變基因具有重要意義。本研究對收集15例胃癌患者從組織形態(tài)學(xué)、免疫組化表型、分子分型等方面深入研究,以期尋找到與胃癌增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的高頻突變基因,為臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取西安大興醫(yī)院醫(yī)院病理科2019—2020年術(shù)前均未經(jīng)治療的手術(shù)切除胃腺癌樣本15例。其中男性12例,女性3例,平均年齡65歲,臨床分期1～2期4例,臨床分期3～4期11例,9例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,6例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有切片均由兩位主治以上醫(yī)師閱片。

1.2 實驗方法

1.2.1 常規(guī)HE染色及免疫組化染色方法 15例標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋切片,4 μm厚度連續(xù)切片,HE染色和免疫組織化學(xué)辣根過氧化物酶偶聯(lián)的酶標(biāo)免疫染色法,檢測指標(biāo)包括:MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、HER-2。免疫組織化學(xué)染色由Ventana Benchmark XT全自動染色儀完成。

一抗試劑:MLH1(克隆號:521I4D5),MSH2(克隆號:644G5A4),MSH6(克隆號:8212G2C1),PMS2(克隆號:157G1F5),HER-2(克隆號:246G0D3),以上抗體購自蘇州百道醫(yī)療科技有限公司。

1.2.2 二代基因測序技術(shù)(NGS) 樣本DNA提取和處理,測序文庫構(gòu)建,探針富集,基因高通量測序,捕獲后的文庫按照OseqTM-T肺癌個體化診療基因檢測文庫構(gòu)建試劑盒,提供突變類型狀態(tài)的評估,共涵蓋了17種癌種,779個外顯子區(qū)域,檢測突變類型包含單核苷酸變異、插入缺失、拷貝數(shù)變異等。首先將DNA在試劑盒的作用下形成DNA簇,然后向反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶,接頭引物,特異性熒光標(biāo)記的dNTP,使用聯(lián)合探針錨定聚合測序法,在HiSeq3000測序平臺上樣,測序平臺通過單個堿基合成后洗脫游離的dNTP和DNA聚合酶,之后進行熒光檢測,計算機分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基,以達到測序的目的。加入試劑中和熒光信號,繼續(xù)下一輪測序反應(yīng)。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀

1.3.1 MMR蛋白的免疫組化表達判讀 至少1種MMR蛋白(MLH1, MSH2, MSH6, PMS2)在腫瘤細(xì)胞中完全喪失核反應(yīng)性,但在背景非腫瘤細(xì)胞中保持核染色,我們將其作為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI);當(dāng)腫瘤細(xì)胞顯示所有4種MMR蛋白的核免疫染色完整時,判斷腫瘤為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS);4個標(biāo)記物中有2個或2個以上不穩(wěn)定的腫瘤被定義為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H),而只有一個標(biāo)記物不穩(wěn)定的腫瘤被歸類為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)。

1.3.2 HER2免疫組化判讀 0(陰性):細(xì)胞膜無著色,或僅有細(xì)胞質(zhì)著色;1+(弱陽性):任何比例細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整膜著色;2+(陽性):>10%的細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強度、完整但不均勻膜棕黃著色或<30%的細(xì)胞呈現(xiàn)完整膜強的棕褐著色;3+(強陽性):>30%的細(xì)胞呈現(xiàn)完整膜強的棕褐著色[6]。

1.4 胃癌的分子分型

癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)將胃癌分為染色體不穩(wěn)定型(CIN)、遺傳穩(wěn)定型(GS)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(MSI)和EBV感染型(EBV)4個分子亞型[7]。MSI和EBV亞型對免疫治療反應(yīng)好。CIN亞型多見于腸型胃癌,并伴有EGFR、VEGFA、CCNE1、CCND1、CDK6基因突變,可占胃癌總突變的50%。GS亞型與彌漫型胃癌發(fā)生相關(guān),常伴有RHOA、CLDN18基因突變,占總突變的19%。EBV亞型常伴有PIK3CA、PDL1/PDL2突變,占總突變類型的10%;MSI型常伴有MLH1、PIK3CA、EGFR突變和PDL1過表達,占總突變類型的19%。EBV、MSI亞型PDL1免疫療法療效顯著[8]。

1.5 隨訪

本研究病例資料信息得到患者的知情同意,隨訪信息通過電話獲得,從手術(shù)切除確診后開始,截止時間2021年9月,患者死亡,隨訪截止。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

15例胃腺癌患者的臨床病例特征及隨訪情況見表1。15例胃腺癌患者病理分期:T1期4例(27%),T3期4例(27%),T4期7例(46%);組織學(xué)分型:低分化腺癌10例(67%),中分化腺癌患者5例(33%);lauren分型:腸型8例(53%),彌漫型7例(47%)。微衛(wèi)星穩(wěn)定表型分型:MSI型1例(6.7%),MSS型14例(93.3%)。胃癌分子分型:CIN型7例(47%),MSI型1例(6%),EBV型3例(20%),GS型4例(27%)。病例12:發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定,體細(xì)胞突變個數(shù)最多(n=31),同時TMB值最高(TMB=51.61);病例4:體細(xì)胞突變個數(shù)最少(n=3),TMB值最低(TMB<0.1)。共6例患者接受了化療,5例低分化腺癌,1例中分化腺癌,其中4例獲得無病生存,2例死亡(病例3化療1療程后因為多發(fā)轉(zhuǎn)移死亡,病例15因并發(fā)肺腺癌治療無效死亡)(見表1)。

表1 15例胃腺癌患者病理、分子臨床特征及隨訪信息

2.2 具有胃癌遺傳特征患者的病理組織學(xué)及免疫組化表達特征

①病例2:低分化腺癌,lauren分型為彌漫型,癌細(xì)胞呈片狀、巢狀彌漫浸潤性生長,胞漿嗜酸,胞核嗜堿;癌細(xì)胞周圍可見大量淋巴細(xì)胞浸潤,局部可見小灶癌巢周圍存在收縮裂隙;分子分型為CIN型(見圖1A)。

②病例12:中分化腺癌,lauren分型為腸型,瘤細(xì)胞呈腺狀分布,腔內(nèi)可見組織細(xì)胞分布,間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(見圖1B);分子分型為MSI型,免疫組化表型顯示MLH1、MSH2、MSH6表達陽性,PMS2表達缺失(見圖1C-F),同時HER-2高表達(3+)(見圖1G)。

③病例13:低分化腺癌,lauren分型為彌漫型,瘤細(xì)胞呈腺樣、條索狀排列,浸潤性生長,瘤細(xì)胞核漿比升高,染色質(zhì)細(xì)膩,細(xì)胞異型性顯著,間質(zhì)內(nèi)少許淋巴細(xì)胞分布;分子分型為CIN型(見圖1H)。

A.病例2:胃癌lauren分型為彌漫型,分子分型為CIN型;B.病例12:胃癌lauren分型為腸型,分子分型為MSI型;C.病例12:MLH1免疫組化染色顯示腺體細(xì)胞核呈中等強度著色;D.病例12:MSH2免疫組化染色顯示腺體細(xì)胞核呈中等強度著色;E.病例12:MSH6免疫組化染色顯示腺體細(xì)胞核呈中等強度著色;F.病例12:PMS2免疫組化染色顯示所有腺體細(xì)胞表達缺失;G.病例12:HER-2免疫組化染色呈胞膜強且完整細(xì)胞膜的染色;H.病例13:胃癌lauren分型為彌漫型,分子分型為CIN型圖1 具有胃癌遺傳特征病例(2,12,13)的組織學(xué)特點 (×400)Figure 1 Pathological features of patients 2,12,13 with hereditary characteristics of gastric cancer (×400)

2.3 二代測序技術(shù)結(jié)果

我們統(tǒng)計檢測出141個基因突變類型,其中1例(1/15,6.7%)檢測出胚系突變:BRIP1(p.T997Rfs*61),同時伴有MUC6、FAT3、TP53、ROS1等體細(xì)胞突變。15例檢測樣本均檢測到體細(xì)胞突變,重現(xiàn)性體細(xì)胞突變基因有TP53(11/15,62.5%),MUC6(4/15,26.7%),MUC16(4/15,26.7%),CRP1B(4/15,26.7%),FAT4(3/15,20%),LRRK2(3/15,20%),PIK3CA(3/15,20%),IDH1(3/15,20%)(見表2)。其中1例(1/15,7%)發(fā)現(xiàn)MLH1基因突變,TP53突變中有2例發(fā)生突變(C.993+1G>T,C.672+1G>T),導(dǎo)致核苷酸由鳥嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?2例核苷酸突變?yōu)樘K氨酸。11例TP53突變病例均為Ⅱ類突變,位點突變亞區(qū)主要集中在外顯子區(qū)域EX7、EX8、EX9,內(nèi)含子區(qū)域IVS6、IVS9。TP53突變組的腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden,TMB)平均值及總值較TP53野生組高(見表3)。另外,15例患者根據(jù)分子分型,MSI組的TMB平均值最高,EBV組的TMB平均值最低(見表4)。

表2 15例胃腺癌患者體細(xì)胞突變類型及頻率

表3 15例胃腺癌患者TP53基因突變與TMB值的差異表達

表4 15例胃腺癌患者分子分型與TMB值的差異表達

另外,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)15例中有3例發(fā)生PIK3CA突變,其中1例發(fā)現(xiàn)合并MUC16、RAD50、EPPK1、SMARCA4的體細(xì)胞突變。我們檢測出除TP53的突變外,還包括PIK3CA、CCNE1、CDH1等已知突變的基因。另外,結(jié)合最新TCGA數(shù)據(jù),我們新發(fā)現(xiàn)一些罕見報道的胃癌體細(xì)胞突變類型,包括AR,GATA1,FAT3,MGA,DOCK2,COLLA1,LRP1B,SESN1,LRRK2,RECQL,PPM1D,EIF4A2,SRSF2,KMT2B,TGFBR1,FRAS1,SHPRH,ZFHX4,ARID2,ABCG2,EXT2,MAP3K4,MYB,SDE1RAB3,LIRF,CSMD3,APOB,EPPK1,KMT5A,MST1,NKX3-1,ARID,ARID1A,STK40,PRDM14,ATAD2,POLH,KIAA1549,LRRK1,LAMA2,STK19。

2.4 隨訪結(jié)果

對15例胃腺癌患者進行隨訪,隨訪時間為40月,其中4例死亡(隨訪時間為12～32月),11例無病生存。病例5:男性,76歲,胃低分化腺癌患者,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,育3子,1子發(fā)現(xiàn)十二指腸息肉,余子尚體健。病例15:男性,65歲,先后發(fā)生胃腺癌及肺腺癌,經(jīng)過2個SOX方案化療后,隨訪21個月死亡。

具有胃癌遺傳特征的病例隨訪結(jié)果:①病例2:女性,61歲,診斷為胃低分化腺癌,患者父親于58歲因胃癌手術(shù)治療,組織學(xué)分型為低分化胃癌,術(shù)后未經(jīng)放化療,現(xiàn)年81歲健在,另該患者的母親、兒子、女兒未發(fā)現(xiàn)疾病。患者本人經(jīng)過5個SOX化療后,目前無病生存。②病例12:男性,67歲,中分化腺癌,微衛(wèi)星不穩(wěn)定患者,隨訪其三代內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其他林奇綜合征遺傳相關(guān)患者。③病例13:女性,78歲,胃低分化腺癌患者,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,育2子4女,其中長子58歲,同年被確診肺小細(xì)胞癌,余子女均體健。

3 討論

隨著基因測序技術(shù)的進步,NGS在惡性腫瘤中的應(yīng)用越來越廣泛,由NGS檢測結(jié)果到轉(zhuǎn)化為患者的個性化精準(zhǔn)治療方案是目前臨床重要的治療方案。NGS能檢測出MSI、TMB、胚系突變基因、體細(xì)胞突變基因等,為患者尋找靶向藥,提供明確的免疫治療參考。然而,目前國內(nèi)NGS在胃癌中的研究不夠深入,國內(nèi)外文獻報道不一致,胃癌基因譜尚未建立,免疫組化表型特異性檢測與二代基因測序檢測的差異,NGS檢測在判斷患者預(yù)后分析、疾病轉(zhuǎn)移、發(fā)生、發(fā)展的臨床價值是目前迫切需要探索的內(nèi)容。

本研究收集15例胃腺癌的腫瘤樣本,通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn):病例12(1/15,6.7%)PMS2蛋白表達缺失,HER-2高表達(3+),與NGS同時證實發(fā)生錯配修復(fù)系統(tǒng)基因的突變,同時伴有ERBB2的突變。隨訪其三代內(nèi)雖然無其他林奇綜合征遺傳相關(guān)患者,考慮與本例為雜合性突變相關(guān)。其余14例患者免疫組化未發(fā)現(xiàn)錯配修復(fù)蛋白缺失,NGS也未發(fā)現(xiàn)錯配修復(fù)系統(tǒng)基因的突變。15例樣本兩種檢測結(jié)果完全符合。研究發(fā)現(xiàn)通過免疫組化及NGS均可發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定且一致性很高。NGS基因檢測不僅可以全面尋找胃癌的突變基因,同時也能確診微衛(wèi)星不穩(wěn)定,在具體檢測方法選擇上可以結(jié)合檢測目的和各自方法的優(yōu)勢進行分析。

胚系突變是重要的突變類型,具有重要遺傳意義,在胃癌中發(fā)生較體細(xì)胞突變概率低。本實驗中胚系基因突變的發(fā)生率為6.7%。病例2發(fā)生BRIP1胚系基因突變,合并TP53、FAT3、ROS1、GLI1等體細(xì)胞突變。BRIP1胚系基因突變在胃癌中非常罕見,且機制尚不清楚。BRIP1基因位于染色體17q220.2,是一種具有解旋酶功能的氨基酸蛋白,參與DNA內(nèi)環(huán)境平衡[9]。根據(jù)OncoKB數(shù)據(jù)庫,大多數(shù)BRIP1突變的胃癌是由于錯配修復(fù)基因或聚合酶ε和δ1基因的伴隨突變造成的高突變。BRCA1和BRCA2突變的遺傳性卵巢癌中,BRIP1-BRCA1相互作用的缺失在卵巢癌體細(xì)胞突變中至關(guān)重要[10];0.6%～0.9%的卵巢癌可能攜帶致病變異BRIP1基因[11]。在缺乏BRCA1或者BRCA2突變的遺傳性乳腺癌中同樣也發(fā)現(xiàn)BRIP1基因突變,導(dǎo)致聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶PARP-DNA復(fù)合物形成是腫瘤發(fā)生的重要原因[12]。在胃食管癌中,BRIP1擴增通常與ERBB2擴增同時發(fā)生,同時在激活的KRAS/BRAF通路基因突變的樣本中出現(xiàn)BRIP1突變[13]。奧拉帕利是目前BRIP1突變的有效靶向藥。病例2經(jīng)過奧沙利鉑聯(lián)合替吉奧聯(lián)合化療5療程,目前無病生存。

既往研究發(fā)現(xiàn)TP53是胃癌中高頻突變基因,與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),是胃癌形成的重要原因,并貫穿了疾病發(fā)生的全過程[14,15],與細(xì)胞周期阻滯、凋亡、DNA修復(fù)等相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌中TP53突變發(fā)生頻率最高(11/15,62.5%),與Fenoglio-Preiser等[16]研究結(jié)果相同。據(jù)報道TP53基因突變患者,合并EB病毒感染較多,預(yù)后較好[17],但其與臨床表型,如總生存率、無病生存率的相關(guān)性尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)TP53體細(xì)胞基因突變主要發(fā)生在外顯子。Moroni等[18]發(fā)現(xiàn)P53p.V143Ac.428A>C純合性突變,使得胃癌患者曲妥珠單抗治療過程中出現(xiàn)耐藥,提示TP53可能是胃癌潛在的治療靶點或耐藥靶點。另外本實驗發(fā)現(xiàn)TP53突變組較野生組具有更高的TMB值,包括均值及總值。TMB值被認(rèn)為是胃癌免疫微環(huán)境的代表值,TMB值越高,越適合免疫治療[19]。TP53突變導(dǎo)致肺癌、卵巢癌、胰腺癌和皮膚癌等腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的增加[20],參與多種復(fù)雜的信號通路,包括調(diào)控基因表達、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄后修飾[21],導(dǎo)致趨化因子和細(xì)胞因子分泌的改變,進而改變免疫微環(huán)境[22,23]。TP53能否成為評估免疫治療的伴隨診斷標(biāo)志物需要進一步實驗證實。

Patricia等[24]指出,TP53基因突變促進細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖。本研究發(fā)現(xiàn)11例TP53突變患者中有8例發(fā)生轉(zhuǎn)移。TCGA公共數(shù)據(jù)庫證實TP53在胃腺癌中的變異頻率為49.55%,在胃癌形成及轉(zhuǎn)移中起到重要作用。胃癌晚期轉(zhuǎn)移是死亡的重要原因,因此找到抑制轉(zhuǎn)移的突變位點對于胃癌治療是一個重要突破點,可以提前進入臨床干預(yù),對胃癌的治療具有重要意義。通過NGS發(fā)現(xiàn)TP53基因突變是腫瘤具有轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險因素,為臨床發(fā)出提前預(yù)防轉(zhuǎn)移的重要信號。

E-鈣黏蛋白(E-cadherin,CDH1)基因突變與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。病例13胃癌lauren分型為彌漫型,其兒子發(fā)生小細(xì)胞肺癌,兩人同時進行二代基因測序檢測,共同發(fā)生了TP53、鈣黏蛋白-9(CDH9)突變。病例15先后發(fā)生胃腺癌及肺腺癌,伴有TP53、CDH1突變。由此發(fā)現(xiàn):鈣黏蛋白與肺癌發(fā)病高風(fēng)險具有一定相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)3例(3/15,20%)lauren分型為彌漫型且CDH1體細(xì)胞突變,與CDH1基因突變與遺傳性彌漫型胃癌有著明確的相關(guān)性這一結(jié)論一致[25]。CDH1基因突變與遺傳性胃癌發(fā)病高風(fēng)險有關(guān)[5],發(fā)生CDH1基因突變患者預(yù)后差[26,27]。當(dāng)E-鈣黏蛋白功能喪失時,表皮細(xì)胞的極性消失并且出現(xiàn)克隆性增生和侵襲性生長。CDH9被認(rèn)為是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因子,作為轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素,成為靶向治療的備選或聯(lián)合研究位點[28]。此前,CDH9突變在胃癌中罕見報道,本研究報道為后續(xù)進一步研究提供病理依據(jù)。

本實驗NGS檢測發(fā)現(xiàn)伴有MUC6、MUC16突變的胃癌患者中5例(5/7,71%)發(fā)生轉(zhuǎn)移,說明伴有MUC6、MUC16基因突變患者與胃癌轉(zhuǎn)移高風(fēng)險相關(guān)。既往有文獻報道在胃印戒細(xì)胞癌中MUC6的表達下調(diào)與胃癌的增殖、浸潤性生長等臨床行為密切相關(guān)[29]。MUC6是一種分泌型黏蛋白,主要存在于胃的幽門腺體、十二指腸腺和賁門腺體中,MUC16通過局灶黏附介導(dǎo)的信號機制參與胰腺導(dǎo)管腺癌的轉(zhuǎn)移,通過CRISPR/CAS9介導(dǎo)的MUC16敲除細(xì)胞導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原減少,提示MUC16-半乳凝素相互作用減少;MUC16可能促進胰腺導(dǎo)管腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[30]。NGS檢測出MUC6、MUC16基因突變時,提示需要預(yù)防胃癌轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險。

NGS選擇TMB值排序在20%以上的病例定義為TMB高值,是繼MSI-H后的又一個腫瘤免疫治療伴隨診斷標(biāo)志物[23]。TMB值越高,體細(xì)胞突變個數(shù)越多,與本研究結(jié)果一致。另外,TMB值越高對免疫治療的應(yīng)答反應(yīng)越好[31],說明NGS在胃癌的免疫治療具有重要提示作用。另外,本研究發(fā)現(xiàn)胃癌分子分型4型中MSI組的TMB平均值最高。但是本研究樣本量小,遺憾無法進一步評估TMB值與患者免疫治療療效、預(yù)后的相關(guān)性。

綜上所述,NGS檢測出胃癌發(fā)生中的胚系突變及高頻體細(xì)胞突變的基因類型如TP53、CDH1、CDH9、MUC6、MUC16等,對胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫治療等具有重要的臨床應(yīng)用價值,并在臨床病理意義分析中發(fā)揮重要作用。NGS檢測基因突變類型高效、多位點,為臨床診療提供更加充足的實驗室依據(jù)。

致謝:感謝西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科楊軍主任醫(yī)師的悉心指導(dǎo),感謝西安大興醫(yī)院胃腸外科施海主任團隊為本實驗提供樣本,同時感謝華大生物檢測有限公司為本實驗完成二代測序?qū)嶒灢糠帧?/p>