趙鳳瓊,楊 宇,李戰(zhàn)梅,周米露,羅云霞

(南充市中心醫(yī)院,川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院眼科,南充 637000)

視神經(jīng)損傷又稱外傷性視神經(jīng)炎病變,屬于常見的眼外傷,會導(dǎo)致視力降低、視野缺損乃至傳入性瞳孔對光反射異常[1]。神經(jīng)損傷發(fā)病與顱腦外傷、動脈硬化、青光眼、高血壓、腦膜炎、敗血癥、視神經(jīng)炎、糖尿病以及各種甲狀腺等代謝類疾病有關(guān)[2]。曾有研究表明,視神經(jīng)損傷是不可逆的[3],但相關(guān)研究報(bào)道,目前約有50%的視神經(jīng)損傷患者會有不同程度上的視力恢復(fù)[4],說明視神經(jīng)損傷后在某種條件下視神經(jīng)可以再生。視神經(jīng)損傷后的再生與多種因素、各個因子的相互作用以及外界環(huán)境具有一定的相關(guān)性。轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)由181個氨基酸組成,是一種適應(yīng)性反應(yīng)基因,在缺血、缺血再灌注、組織損傷、化學(xué)毒素等應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)[5]。相關(guān)研究表明,ATF3在神經(jīng)損傷后的表達(dá)明顯上調(diào),視為神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)損傷的獨(dú)特神經(jīng)元標(biāo)記物[6],故推測視神經(jīng)損傷可能與ATF3表達(dá)相關(guān)。本研究通過探討ATF3在視神經(jīng)損傷后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活中的作用和分子機(jī)制,為治療視神經(jīng)損傷相關(guān)疾病提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雌性SD大鼠65只,清潔級,無眼部疾病,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,許可證號:SYXK(京)2017-0033,體質(zhì)量210～250 g,12 h光照和12 h黑暗交替,溫度和濕度相對恒定,分籠飼養(yǎng),每籠5只,自由飲食和飲水。

1.1.2 主要試劑和儀器 ATF3抗體購自美國abcam公司;ATF3過表達(dá)質(zhì)粒引物序列(pIRES2/ATF3)、ATF3-shRNA表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照(shNC)序列由上海吉瑪基因有限公司合成;CCK-8試劑盒購自中國biosharp生物科技公司;BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,GAPDH抗體購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒購自美國abcam公司;光學(xué)顯微鏡、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司;DNA電泳儀設(shè)備購自北京市六一儀器廠;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司;OCT(Cirrus-HD 4000)購自德國Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 視神經(jīng)損傷模型建立 從65只大鼠中,隨機(jī)取55只大鼠,建立右眼視神經(jīng)損傷模型[7](實(shí)際使用51只),作為視神經(jīng)損傷組,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,將大鼠固定手術(shù)臺上,鈍性分離暴露視神經(jīng)眶內(nèi)段,采用中號顯微血管夾在大鼠視神經(jīng)眼球后2 mm處夾住,夾持力大約為98 g,時間為20 s,術(shù)中術(shù)眼對光的反射消失,眼瞳孔散大,檢眼鏡下沒有看到視網(wǎng)膜的完全缺血,采用8-0尼龍線縫合球結(jié)膜2針,術(shù)后當(dāng)天使用紅霉素眼膏外敷右眼,視神經(jīng)損傷動物模型建立術(shù)后,手術(shù)切口愈合較好,無滲血滲液,無化膿,眼角膜透明,玻璃體無積血和炎性反應(yīng),無視網(wǎng)膜脫離發(fā)生,瞳孔散大約4 mm,并進(jìn)行直接對光反射和間接對光反射檢查,發(fā)現(xiàn)間接反射良好,直接對光反射遲鈍或者消失,即視為建模成功。剩余10只正常大鼠作為對照組(實(shí)際使用9只)。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測視網(wǎng)膜中ATF3的表達(dá) 取對照組大鼠3只、視神經(jīng)損傷組大鼠3只,10%水合氯醛腹腔注射大鼠,待完全麻醉后處死,大鼠仰臥位并固定四肢,剪開球結(jié)膜,鈍性分離眼周組織,球后視神經(jīng)約2 mm位置剪斷視神經(jīng),采用平鑷和剪刀摘出眼球,分離視網(wǎng)膜,4%戊二醛固定,-80 ℃保存。選取凍存標(biāo)本剪碎并研磨,Trizol溶液進(jìn)行裂解,按照產(chǎn)品說明書采用一步法提取總RNA,再按照使用說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cRNA,采用primer premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)合成引物,ATF3上游引物序列:5′-ACTGTCGGTCCAGAGTGCTT-3′,下游引物序列:5′-CAGTGCTGATCTGGATGTGTG-3′;以GAPDH作為內(nèi)參,GAPDH上游引物序列:5′-GAAAGATGGCTCACCGGG-3′,下游引物序列:5′-GCTTCACCTCCTTGCCACT-3′。應(yīng)用ABI step one plus system定量PCR儀,熱循環(huán)條件為50 ℃ 2 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 15 s,57 ℃ 30 s,共30個循環(huán),檢測ATF3 mRNA的表達(dá)水平。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測ATF3的表達(dá) 取對照組大鼠3只、視神經(jīng)損傷組大鼠8只,視神經(jīng)損傷組大鼠分別于感染后3,7,14,35 d采用水合氯醛溶液麻醉處死大鼠,各時點(diǎn)處殺2只,取右眼球,采用40 g/L多聚甲醛固定,去除晶狀體后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟之后,采用石蠟包埋,平行于眼球矢狀位,進(jìn)行連續(xù)切片,厚度為4 μm。然后在0.3%的H2O2去離子水中孵育30 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗;采用1%牛血清白蛋白進(jìn)行抗原封閉20 min,然后在一抗中孵育30 min,沖洗5 min,生物素標(biāo)記的二抗孵育30 min,沖洗5 min,在氧化物酶底物溶液中孵育,觀察染色強(qiáng)度,自來水沖洗,復(fù)染、分化、脫水、透明,封片,高倍顯微鏡隨機(jī)選取5個視野拍照保存,計(jì)算各切片的陽性細(xì)胞數(shù),以每個視野100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞的數(shù)量計(jì)算各切片的平均陽性細(xì)胞數(shù)觀察ATF3陽性表達(dá)情況。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.4 免疫熒光組織化學(xué)檢測膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá) 取對照組大鼠3只、視神經(jīng)損傷組大鼠8只,采用水合氯醛溶液對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉,開胸經(jīng)左心室插管至主動脈,上腔靜脈開口排出灌注液,灌注生理鹽水,立即取視神經(jīng)標(biāo)本置于2.5%戊二醛固定液中,視神經(jīng)損傷組大鼠分別于感染后3,7,14,35 d處死大鼠,各時點(diǎn)處殺2只,摘除眼球并標(biāo)記,4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋,通過視神經(jīng)乳頭,沿眼球的垂直經(jīng)線行前后方向視網(wǎng)膜全層進(jìn)行切片,厚度為6 μm,放在含有0.3%Triton X-100%和10%正常驢血清中封閉1 h,添加一抗GFAP抗體(1 ∶1 000)孵育過夜,洗滌后,加二級抗體(結(jié)合Alexa 488熒光驢抗鼠IgG和結(jié)合Alexa 555的驢抗兔IgG)孵育,PBS清洗。熒光顯微鏡獲取圖像,并使用ImageJ軟件進(jìn)行分析,用共焦顯微鏡進(jìn)行成像。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)厚度測量 取32只視神經(jīng)損傷組大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,分別為NC組、ATF3過表達(dá)質(zhì)粒(pIRES2/ATF3)組、陰性對照(shNC)組和ATF3-shRNA組。除NC組外,其他組分別轉(zhuǎn)染pIRES2-ATF3過表達(dá)質(zhì)粒、ATF3-shRNA表達(dá)質(zhì)粒和shNC,參照Lipofectamine的說明書,分別將ATF3過表達(dá)質(zhì)粒、ATF3-shRNA表達(dá)質(zhì)粒和shNC采用PBS溶解,然后和相應(yīng)體積的脂質(zhì)體混勻,室溫下靜置30 min,再加入PBS,各得到總量為200 μl。將NC組大鼠腹腔注射生理鹽水500 μl;pIRES2/ATF3組大鼠注射ATF3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的復(fù)合物;shNC組注射shNC的復(fù)合物;ATF3-shRNA組注射ATF3-shRNA表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)合物。采用SD-OCT掃描,測量感染后0,7,14,35 d的RNFL厚度。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.6 OCT檢查 按1.2.5實(shí)驗(yàn)分組,NC組、pIRES2/ATF3組、shNC組、ATF3-shRNA組各取8只大鼠采用OCT掃描,測量感染后0,7,14,35 d的RNFL厚度,每個時點(diǎn)各取2只,每只大鼠僅檢查右眼,撐開眼瞼,固定于OCT頜架合適位置,保證OCT探測光源對準(zhǔn)視乳頭,采用監(jiān)視屏觀察,采用Optic Disc Cube 200×200程序進(jìn)行掃描,選擇RNFL和ONH OU程序分析結(jié)果,重復(fù)測量3次。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.7 分離視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分離,大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉處死,取出視網(wǎng)膜,溶解于0.04 g/L的脫氧核糖、0.2 g/L左旋/右旋半胱氨酸和15 U/ml木瓜蛋白酶的混合液中,離心處理,加入IgG抗體(1 ∶400)和兔抗巨噬細(xì)胞抗體(1 ∶75)孵育30 min,再將貼壁的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胰蛋白酶消化,離心處理后,將視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接種于96孔板中,放含有0.01 g/L慶大霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng),放在溫度為37 ℃,5%CO2條件下,每3 d更換液體1次,流式細(xì)胞術(shù)檢測活化星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,并計(jì)算視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞純度。

1.2.8 CCK-8法檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況 按1.2.5實(shí)驗(yàn)分組,NC組、pIRES2/ATF3組、shNC組、ATF3-shRNA組每組取8只大鼠,感染后0,7,14,35 d每個時間取2只大鼠,將4組大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胰酶消化,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/孔,待細(xì)胞貼壁生長,加入不同濃度DATS,分別進(jìn)行培養(yǎng),再向細(xì)胞中加入CCK-8工作液,溫度為37 ℃;酶標(biāo)儀在450 nm下完成吸光度值測定(OD)值。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況 按1.2.5實(shí)驗(yàn)分組,NC組、pIRES2/ATF3組、shNC組、ATF3-shRNA組感染后14 d每組取2只大鼠,將4組大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以每孔1×106個細(xì)胞接種于24孔板中。孵育過夜,按照制造商說明書,用Annexin Ⅴ-FITC-PI凋亡試劑盒染色,上流式細(xì)胞儀上檢測,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組各樣本均做3個平行樣。

1.2.10 免疫印跡法檢測Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的表達(dá) 按1.2.5實(shí)驗(yàn)分組,NC組、pIRES2/ATF3組、shNC組、ATF3-shRNA組感染后14 d每組取2只大鼠,RIPA裂解液提取神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,聚丙烯酞胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜,將膜浸入5%脫脂牛奶的封閉液中,封閉1 h。分別加入Bax(1 ∶1 000)和Bcl-2(1 ∶1 000)一抗,放于4 ℃環(huán)境中孵育過夜,添加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),孵育1 h,將PVDF膜放入到電化學(xué)發(fā)光顯色液內(nèi),顯色處理,使用Image-Pro Plus分析蛋白質(zhì)灰度值。各組各樣本均做3個平行樣。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ATF3在大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,對照組和視神經(jīng)損傷組中ATF3 mRNA表達(dá)分別為1.02±0.01和2.69±0.43,視神經(jīng)損傷組ATF3 mRNA明顯高于對照組(t=11.648,P=0.000,見圖1)。

2.2 大鼠視神經(jīng)受損后視網(wǎng)膜中ATF3與GFAP的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),ATF3陽性染色呈深棕色,感染后35 d時在視網(wǎng)膜中大量存在(見圖2)。對照組、視神經(jīng)損傷組感染后3,7,14,35 d的ATF3蛋白陽性相對表達(dá)分別為1.26±0.28,2.96±0.81,6.33±1.48,7.27±2.14,12.07±3.39,與對照組相比,感染后3,7,14,35 d視神經(jīng)損傷組大鼠ATF3陽性細(xì)胞的表達(dá)增加(P<0.05,見圖2),在感染后35 d,ATF3的陽性細(xì)胞表達(dá)在視網(wǎng)膜中大量存在。

與對照組比較,*P<0.05圖1 ATF3 mRNA在正常大鼠神經(jīng)組織和視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中的表達(dá)Figure 1 Expression of ATF3 mRNA in normal rat nerve tissue and retina after optic nerve injury

免疫熒光組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:對照組中GFAP僅在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層表達(dá)(見圖2)。損傷后,GFAP的表達(dá)通過內(nèi)網(wǎng)狀層(IPL)和內(nèi)核層(INL)向外核層(ONL)傳遞,與對照組相比,視神經(jīng)損傷大鼠GFAP在感染后3,7,14,35 d的表達(dá)增加(P<0.05,見圖2),在感染后35 d,視網(wǎng)膜中出現(xiàn)大量的GFAP,提示視神經(jīng)受損后,ATF3與GFAP的表達(dá)水平升高。

2.3 ATF3對RNFL厚度的影響

感染后0,7 d,pIRES2/ATF3組上象限、顳側(cè)、下象限、鼻側(cè)RNFL厚度以及RNFL的平均厚度與NC組比較無明顯差異(P>0.05,見表1);感染后14,35 d,與NC組比較,pIRES2/ATF3組中上象限、顳側(cè)、下象限、鼻側(cè)RNFL厚度以及RNFL的平均厚度顯著減少(P<0.05,見表1)。

感染后0,7 d,與shNC組比較,ATF3-shRNA組上象限、顳側(cè)、下象限、鼻側(cè)RNFL厚度以及RNFL的平均厚度比較無明顯差異(P>0.05,見表2);感染后14,35 d,與shNC組比較,ATF3-shRNA組上象限、顳側(cè)、下象限、鼻側(cè)RNFL厚度以及RNFL的平均厚度明顯增加(P<0.05,見表2)。

與對照組比較,*P<0.05圖2 大鼠視神經(jīng)受損后視網(wǎng)膜中ATF3與GFAP的表達(dá)Figure 2 Expression of ATF3 and GFAP in rat retina after optic nerve injury

表1 NC組和pIRES2/ATF3組不同時點(diǎn)RNFL厚度比較

表2 shNC組和ATF3-shRNA組不同時點(diǎn)RNFL厚度比較

2.4 ATF3對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與NC組比較,感染后14,35 d,pIRES2/ATF3組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05);與shNC組比較,ATF3-shRNA組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05,見圖3)。

與NC組或shNC組相比,*P<0.05圖3 ATF3對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的影響Figure 3 Effect of ATF3 on survival of retinal ganglion cells

2.5 ATF3對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與NC組比較,pIRES2/ATF3組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與shNC組比較,ATF3-shRNA組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05,見圖4)。

與NC組或shNC組相比,*P<0.05圖4 ATF3對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of ATF3 on apoptosis of retinal ganglion cells

2.6 ATF3對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白影響

免疫印跡法檢測結(jié)果顯示,與NC組比較,pIRES2/ATF3組中Bax蛋白水平明顯升高,Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05,見圖5);與shNC組比較,ATF3-shRNA組中Bax蛋白水平明顯降低,Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05,見圖5)。

與NC組或shNC組相比,*P<0.05圖5 ATF3對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure 5 Effect of ATF3 on apoptosis-related proteins of retinal ganglion cells

3 討論

視神經(jīng)損傷一般是由于顱腦損傷或者頜面部外傷而引起的一系列并發(fā)癥,該病預(yù)后較差[9]。因其自身的解剖學(xué)特點(diǎn),損傷的部位多為視神經(jīng)管段,該段的神經(jīng)走形特點(diǎn)決定了其致傷原因是間接性的[10]。視神經(jīng)的損傷多由于眼球外傷、受壓迫和眼眶骨折間接傷害引起。該病一旦確診應(yīng)當(dāng)及時救治,從而及時減輕視神經(jīng)的水腫,擴(kuò)張局部血管,增加血流量促進(jìn)血液微循環(huán),起到營養(yǎng)視神經(jīng)并且加強(qiáng)信號傳導(dǎo)的作用[11]。視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目的減少是導(dǎo)致視功能下降的主要原因,而細(xì)胞數(shù)量的減少是由凋亡、壞死引起[12]。相關(guān)研究表明,視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有有限的再生能力,所以抑制視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞壞死和干擾其凋亡的過程,對于視覺損傷后視覺功能的恢復(fù)具有重要的作用[13]。

ATF3為ATF/CREB家族的重要成員之一,其家族包括眾多的堿性區(qū)-亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子,比較典型的代表為ATF3、ATF4、CREB和CREBP1等[14]。其中ATF3在不同組織中的表現(xiàn)功能存在一定的差異,在正常情況下,ATF3的表達(dá)水平較低,但受其他細(xì)胞因子、生長因子和毒性應(yīng)激劑等的刺激,其表達(dá)會明顯的上升[15]。相關(guān)研究表明,ATF3參加人體的多種生物學(xué)功能,包括細(xì)胞黏附、傷口愈合、炎癥反應(yīng)以及維持身體的環(huán)境平衡等[16]。ATF3基因在腫瘤的發(fā)展中扮演著正反兩方面的作用,既能夠抑癌,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,又能促癌,促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[17]。曾有研究報(bào)道,ATF3在組織損傷早期反應(yīng)中也起著主要作用,在神經(jīng)元代謝機(jī)制中具有促進(jìn)存活和再生的功能,在多種組織中的應(yīng)激反應(yīng)中被誘導(dǎo)[18]。ATF3可以介導(dǎo)多種基因的轉(zhuǎn)錄,在應(yīng)激和損傷中是必不可少的因子。雖然ATF3在壓力損傷中上調(diào),但對視神經(jīng)損傷后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況尚不清楚,所以本研究探討ATF3表達(dá)對視神經(jīng)損傷后對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡的影響,為臨床視神經(jīng)損傷的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證了ATF3在大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中的表達(dá),結(jié)果顯示:視神經(jīng)損傷的大鼠視網(wǎng)膜中ATF3的表達(dá)明顯升高,免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果也顯示,ATF3隨著時間的延長,表達(dá)逐漸增加,且感染后35 d,ATF3的表達(dá)在視網(wǎng)膜中大量的存在。說明ATF3在視神經(jīng)損傷中表達(dá)升高,且隨著損傷時間的延長,表達(dá)會逐漸上升。相關(guān)研究只表明ATF3在不同壓力的作用下表達(dá)升高[19],而未報(bào)道ATF3隨著時間而產(chǎn)生不同的變化。為了證明ATF3在視神經(jīng)損傷的表達(dá)作用,本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光組織化學(xué)檢測GFAP表達(dá),結(jié)果顯示:GFAP在感染后3,7,14 d表達(dá)逐漸增加,在感染后35 d視網(wǎng)膜中出現(xiàn)大量的GFAP。GFAP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種獨(dú)特的細(xì)胞骨架蛋白,星形膠質(zhì)細(xì)胞及Müller是視網(wǎng)膜主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,在星形膠質(zhì)細(xì)胞受損時GFAP的表達(dá)明顯增加[20],并產(chǎn)生角質(zhì)化反應(yīng),可以活化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放一系列生長因子,對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)和再生作用。另外,GFAP對于評估創(chuàng)傷性腦外傷損傷嚴(yán)重程度、監(jiān)測繼發(fā)性腦損傷以及預(yù)后也是最具潛力的生物標(biāo)志物[21]。

為了驗(yàn)證ATF3在大鼠視神經(jīng)損傷后的作用,本研究采用SD-OCT掃描測量RNFL厚度,結(jié)果顯示:感染后14,35 d,促進(jìn)ATF3的表達(dá),RNFL厚度顯著減少,沉默ATF3的表達(dá),RNFL厚度明顯增加;又繼續(xù)驗(yàn)證ATF3對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡的影響,結(jié)果顯示:促進(jìn)ATF3的表達(dá),視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活顯著降低,凋亡率顯著升高,且相關(guān)凋亡Bax蛋白水平升高;沉默ATF3的表達(dá),視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活顯著升高,凋亡率明顯降低,且Bcl-2表達(dá)升高。相關(guān)研究表明,下調(diào)ATF3的表達(dá)能抑制Sw-13和NCI-H259R細(xì)胞增殖,激活細(xì)胞凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。也有研究報(bào)道,上調(diào)ATF3的表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[23],說明ATF3也起到了促癌作用,與本研究相反。

綜上所述,ATF3視神經(jīng)損傷的大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)升高,ATF3能夠調(diào)控視神經(jīng)損傷后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡能力,在大鼠視神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用,為臨床上視神經(jīng)損傷治療提供一些思路。