陳 焱,韓沖芳,楊文曲,趙雪麗,常 鑫

(1山西醫(yī)科大學麻醉學院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學第三醫(yī)院,山西白求恩醫(yī)院,山西醫(yī)學科學院,同濟山西醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:hanchongfang2003@foxmail.com)

雌激素可以舒張冠脈、降低血壓和調節(jié)膽固醇代謝,從而改善冠脈微循環(huán)并降低冠脈硬化的風險[1-3]。由于雌激素水平降低,圍絕經期女性冠心病發(fā)病率顯著增加[4]。及時恢復心肌血流灌注是治療冠心病心肌缺血的必要措施。然而在成年雄性大鼠中,心肌再灌注過程不僅會導致心肌損傷,也會損傷腦組織[5]。研究認為,雌激素可通過減輕心肌再灌注損傷引發(fā)氧化應激反應,減少梗死面積并改善心功能[6]。雌激素也可以抑制神經炎癥反應的激活、維持神經元活性和功能,對創(chuàng)傷性和缺血性腦損傷起到保護作用[7,8]。心肌缺血再灌注損傷對圍絕經期大鼠認知功能和雌激素水平的影響尚不清楚,本研究擬探討心肌缺血再灌注損傷對圍絕經期大鼠認知功能和雌激素水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇

雌性健康SD大鼠60只,15～20月齡,由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠均在(23±3)℃潔凈干燥、水與食物充足的環(huán)境中適應7 d,晝夜各12 h。造模前禁食12 h,不禁水。

1.2 實驗動物分組與心肌缺血再灌注模型的制備

采用隨機數字表法分為3組(n=20):對照組(Con組)、假手術組(sham組)、心肌缺血再灌注組(MIR組)。MIR組大鼠在自制麻醉箱中以3%七氟醚(批號:0Z072,Maruiahi Pharmaceutical Co,中國深圳)進行麻醉誘導5 min,以2%七氟醚維持麻醉2.5 h。行經口氣管插管,連接ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)行機械通氣(頻率60次/min、潮氣量20 ml/kg、吸/呼比1 ∶2),行股動脈穿刺置管術并通過BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)行心電、血壓監(jiān)護。經胸骨左緣3～4肋間開胸,打開心包,在左心耳根部與肺動脈圓錐之間用6-0絲線結扎冠狀動脈左前降支。30 min后松開絲線,恢復灌注120 min后縫合組織關閉胸腔,采用荷包縫合法縫皮。sham組僅穿線不結扎;Con組不加處理。

1.3 實驗方法

1.3.1 Morris水迷宮試驗檢測大鼠學習、運動能力與認知功能 三組大鼠造模前連續(xù)6 d行定向航行試驗,每日3次。平臺固定于SE象限。引導大鼠在平臺上學習30 s后,隨機將其放入任意象限。通過攝像系統(tǒng)化軟件自動跟蹤記錄其各時日游泳速度和潛伏期。如60 s內大鼠未找到平臺,則潛伏期記為60 s,并再次引導大鼠在平臺學習15 s。定向航行試驗中游泳速度反應大鼠造模前運動能力,潛伏期反應大鼠造模前學習、記憶認知功能。

造模1 d后行空間探索試驗。撤去平臺,將軟件設置為識別原平臺所在位置。將大鼠隨機放入任意象限,跟蹤記錄大鼠游泳速度和穿越原平臺的次數?？臻g探索試驗中游泳速度反應大鼠造模后運動能力,穿越平臺次數反應大鼠造模后記憶認知功能。

1.3.2 ELISA法檢測大鼠血清cTnI濃度 MIR組大鼠于結扎冠狀動脈左前降支前和造模后分別抽取股動脈血5 ml,室溫靜置2 min,4 ℃ 3 500 r/min離心5 min。取上清液,分裝,于-80 ℃冰箱保存。按照cTnI ELISA定量檢測試劑盒說明書(泉州市睿信生物科技有限公司,RX302234R)測定450 nm波長下的吸光度,繪制標準品曲線,計算大鼠心肌缺血前和造模后血清cTnI濃度。

1.3.3 ELISA法檢測大鼠血清雌激素濃度 Con組和sham組大鼠于造模后抽取股動脈血3 ml,室溫靜置后,4 ℃ 3 500 r/min離心5 min,取上清液,同時取MIR組大鼠造模后上清液樣本,按照E2 ELISA定量檢測試劑盒說明書(泉州市睿信生物科技有限公司,RXJ302812R),繪制標準品曲線,計算各組大鼠造模后血清雌激素水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MIR組血清cTnI濃度配對分析

造模后血清cTnI濃度較結扎冠狀動脈左前降支前血清cTnI濃度顯著升高[(1.95±0.33)μg/Lvs(0.59±0.16)μg/L,t=17.06,P<0.05]。

2.2 水迷宮試驗結果

2.2.1 定向航行試驗結果 3組間大鼠各日游泳速度和潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1,2),各組大鼠潛伏期均逐日縮短。

圖1 各組大鼠在定向航行試驗中的游泳速度Figure 1 Swimming speed of rats in the place navigation test in each group

2.2.2 空間探索試驗結果 Con組、sham組和MIR組大鼠游泳速度分別為(15.60±1.32)cm/s、(16.02±1.30)cm/s和(15.78±1.32)cm/s,三組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。Con組、sham組和MIR組穿越平臺次數分別為(18.65±4.16)次、(13.00±3.45)次和(6.85±3.73)次;與Con組相比,sham組和MIR組大鼠穿越平臺次數顯著減少(P<0.05);與sham組相比,MIR組大鼠穿越平臺次數顯著減少(P<0.05,見圖4)。

圖2 各組大鼠在定向航行試驗中的潛伏期Figure 2 Latency of rats in the place navigation test in each group

圖3 各組大鼠在空間探索試驗中的游泳速度Figure 3 Swimming speed of rats in the space navigation test in each group

與Con組相比，*P<0.05;與sham組相比，#P<0.05圖4 各組大鼠在空間探索試驗中穿越平臺次數Figure 4 Times of crossing the platform of rats in the place navigation test in each group

2.3 造模后各組大鼠雌激素水平

Con組、sham組和MIR組大鼠造模后雌激素水平分別為(87.70±18.62)pg/ml、(90.00±16.07)pg/ml和(94.82±20.35)pg/ml,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖5)。

圖5 各組大鼠造模后雌激素水平Figure 5 Levels of estrogen after the modeling in each group

3 討論

本研究參照文獻[9]采用經典的方法結扎冠狀動脈左前降支30 min再灌注120 min制備圍絕經期大鼠心肌缺血再灌注模型,并通過心肌損傷的高特異性和高敏感性標志物血清cTnI檢驗模型制備情況,結果表明再灌注后血清cTnI濃度較結扎前顯著上調,提示圍絕經期大鼠心肌缺血再灌注模型制備成功。

自圍絕經期開始,雌激素水平不斷下降使其介導的心血管保護作用也逐漸減弱,女性冠心病發(fā)病率隨之顯著上升,且自然絕經早期更易罹患冠心病[10,11]。盡快恢復冠脈血流灌注是冠心病治療措施的核心目標。而心肌再灌注過程不僅會加重心肌組織損傷、損害心功能,還會導致語言、記憶、認知速度與執(zhí)行功能等認知功能下降[12,13]。研究表明,心肌缺血再灌注損傷可以引發(fā)成年雄性大鼠空間記憶障礙和長時程增強受損等海馬依賴性認知障礙[13,14]。心肌缺血再灌注損傷是否會對圍絕經期大鼠認知功能造成相似的損傷,尚未得到證實。本研究通過Morris水迷宮定向航行試驗和空間探索試驗分別評價心肌缺血再灌注損傷前后圍絕經期大鼠海馬依賴性空間學習能力和記憶水平,判斷心肌缺血再灌注損傷對圍絕經期大鼠認知功能的影響。定向航行試驗結果顯示,各組大鼠每日游泳速度和潛伏期均無顯著差異,表明各組大鼠學習和運動能力相仿;潛伏期呈現逐日縮短的趨勢,提示各組大鼠均對平臺位置產生了相對明確的記憶,排除了各組大鼠造模前學習與運動能力差異對造模后水迷宮試驗結果的影響?？臻g探索試驗結果顯示,各組大鼠造模后運動能力仍相仿而MIR組大鼠穿越平臺次數顯著減少,表明心肌缺血再灌注損傷引起了圍絕經期大鼠海馬依賴性認知功能下降。

雌二醇是活性最強的雌激素,可以維持缺血再灌注后心肌細胞線粒體膜電位,減少ROS生成,促進心功能恢復,也可以與中樞神經系統(tǒng)中相應受體結合,提高與記憶和執(zhí)行功能有關腦區(qū)的神經元突觸發(fā)生和可塑性調節(jié),從而促進記憶形成[6,15]。研究表明,雌激素缺乏會降低雌鼠海馬突觸蛋白水平,引發(fā)空間學習和記憶缺陷[16]。為探究心肌缺血再灌注損傷是否通過改變雌激素水平引發(fā)圍絕經期大鼠認知障礙,本研究通過ELISA定量檢測,發(fā)現各組大鼠造模后血清雌激素水平無顯著差異,表明心肌缺血再灌注后圍絕經期大鼠雌激素水平無顯著改變,因而排除了心肌缺血再灌注后內源性雌激素水平對認知功能的影響。研究發(fā)現,外源性補充雌二醇可以減輕繼發(fā)性腦損傷,改善認知功能[17,18]。由此推測,雖然心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)認知水平下降的過程不影響雌激素水平,但外源性雌二醇補充也可能有利于圍絕經期大鼠心肌缺血再灌注后認知功能的改善,后續(xù)可對此進一步研究,為臨床治療提供思路。

不足之處:本研究未設置外源性雌二醇補充組或去勢大鼠組作對照,未能判斷雌激素水平的變化是否影響心肌缺血再灌注后認知水平。

綜上所述,心肌缺血再灌注損傷會引發(fā)圍絕經期大鼠海馬依賴性認知功能下降,但不影響圍絕經期大鼠血清雌激素水平。