廉曉芯， 朱若楠， 吳洪欽， 王 波， 王慶宇， 趙 強(qiáng)*

(1.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083； 2.科爾沁右翼前旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137705)

花紅(MalusasiaticaNakai)，又名沙果、文林朗果、林檎等，是一種果皮為紅色，果肉為黃白色的薔薇科蘋果屬植物，含有豐富的多酚、維生素、有機(jī)酸、膳食纖維等，具有除煩消食、明目泄火的作用[1]。沙果耐寒性強(qiáng)，主要分布于較為寒冷的內(nèi)蒙古東北部地區(qū)，以內(nèi)蒙古科爾沁右翼前旗為代表[2]。沙果中的多酚含量突出，具有很強(qiáng)的DPPH 自由基、羥基自由基及過氧化物清除能力，被稱為“第七類營養(yǎng)素”[3]。沙果多酚的提取和應(yīng)用是沙果增值的新途徑，能有效促進(jìn)其主產(chǎn)地科爾沁右翼前旗地區(qū)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。植物多酚常用的提取方法有無水乙醇浸提法、水浴振蕩法、超聲波提取法等[4-8]。傳統(tǒng)的無水乙醇法提取率低、溶劑消耗量大；超聲波提取法雖然耗時少、產(chǎn)量高，但能耗較高、對人體存在一定的傷害。采用水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足之處。目前對于沙果青果和熟果中多酚含量及種類的報道較少，通過探究沙果多酚最優(yōu)提取工藝，并進(jìn)一步分析沙果果干中多酚種類，可以比較多酚種類對沙果青果和熟果營養(yǎng)價值的影響。利用水浴振蕩輔助乙醇提取法提取沙果多酚，通過對沙果中多酚含量和種類進(jìn)行檢測，對比沙果青果、熟果多酚含量，考察多酚種類對沙果營養(yǎng)價值的影響，以期得出一種綠色環(huán)保、高效的沙果多酚提取方法，為沙果產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其多酚類物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

沙果，含水率9.4%，購自科爾沁右翼前旗恒佳果業(yè)公司，由該公司總經(jīng)理李玉成鑒定為沙果(MalusasiaticaNakai)。沙果青果、熟果去核削片，保留熟果果核中果籽，一并置于55 ℃ 烘箱中烘干36 h，粉碎過25 mm篩后備用；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、無水碳酸鈉(AR≥99.5%)、福林酚染色劑、無水乙醇等均為分析純；綠原酸、(+)- 兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、阿魏酸、根皮苷、根皮素標(biāo)準(zhǔn)品等均為市售色譜級。

KQ5200B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司；800Y 多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；UV-2600 型紫外可見光分光光度計，尤尼柯(上海)有限公司；Modulyod-230型真空冷凍干燥機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；Precision HLG3型真空旋蒸器，德國Heidolph公司；1260型液相色譜儀，日本安捷倫公司；Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker 光譜儀器公司。

1.2 多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[9]，分別取20 g/L 沒食子酸溶液0、 0.25、 0.50、 0.75、 1.00、 1.25和1.50 mL置于10 mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確稱取10 g 無水碳酸鈉，用去離子水溶解定容至100 mL配制成10% Na2CO3溶液。搖勻并靜置5 min。移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 于10 mL 比色管中，加入3.0 mL 福林酚試劑，再向比色管中加入1.0 mL 10% Na2CO3溶液，搖勻， 40 ℃水浴反應(yīng)2 h后于765 nm處測定吸光度，繪制多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.047 7X-0.008(R2=0.999 2)。

1.3 水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚的工藝優(yōu)化

為進(jìn)一步提高沙果多酚提取率，以多酚得率為考察指標(biāo)，在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇影響提取效果的4個提取條件(乙醇體積分?jǐn)?shù)、振蕩時間、料液比和振蕩溫度)為4個主要因素。每個因素選擇3個水平進(jìn)行L9(34)正交試驗優(yōu)化水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚(表1)。具體操作如下：

各取2 g沙果青果干粉末于100 mL 錐形瓶中，按一定料液比(1 ∶15～1 ∶25，g ∶mL)加入乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為50%～70%)，水浴(溫度30～50 ℃)振蕩處理(30～50 min)，真空抽濾后取濾液，用乙醇溶液定容至50 mL，搖勻。取1.0 mL上述溶液按照1.2節(jié)的方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測液中多酚含量。用選擇的較優(yōu)提取沙果青果工藝對沙果熟果、果籽進(jìn)行提取多酚，并按1.2節(jié)操作，計算多酚得率。

1.4 HPLC測定沙果多酚組成

參考文獻(xiàn)[9-10]對多酚類化合物進(jìn)行HPLC組分檢測。色譜條件為：安捷倫1260液相系統(tǒng)，G4212B型DAD檢測器，色譜柱為C18 PLUS柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

HPLC 分析條件為[10]：A為0.1%甲酸，B為0.1%甲酸-乙腈(體積比50 ∶50)。流動相為A與B的混合液，且隨時間變化，A與B的比例變化。梯度洗脫：0～45 min，77%～50% A，23%～50% B；45～65 min，50～20% A，50%～80% B；65～68 min，20%～0% A,80%～100% B；68～73 min，100% B；73～76 min，0%～77% A，100%～23% B；76～80 min，77% A23% B。檢測波長為280 nm(原花青素)、 330 nm(酚酸),流速為1 mL/min，溫度為室溫(25 ℃)，進(jìn)樣量為20 μL 。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙果多酚提取

2.1.1正交試驗 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、振蕩時間(B)、料液比(C)和振蕩溫度(D)4因素3水平進(jìn)行沙果青果的L9(34) 正交試驗，結(jié)果見表1。極差分析結(jié)果表明：影響沙果青果多酚得率的因素的主次關(guān)系是A>B>D>C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最大，水浴振蕩時間次之，水浴振蕩溫度第三，料液比最小，最佳工藝為A1B3C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，水浴振蕩時間50 min,料液比1 ∶25，水浴振蕩溫度30 ℃。在該條件下進(jìn)行3次驗證試驗，沙果青果平均多酚得率為(7.875±0.008) mg/g。

表1 沙果青果多酚提取正交試驗結(jié)果

沙果熟果的L9(34)正交試驗結(jié)果見表2。極差分析結(jié)果表明：影響沙果熟果多酚含量的因素的主次關(guān)系是D>C>A>B，即水浴振蕩溫度影響最大，料液比次之，乙醇濃度第三，水浴振蕩時間最小，最佳工藝為A2B1C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴振蕩時間30 min,料液比1 ∶25，水浴振蕩溫度40 ℃。在該條件下進(jìn)行3次驗證試驗，沙果熟果平均多酚得率為(10.259±0.020) mg/g。

2.1.2沙果青果、熟果多酚含量比較 在2.1.1節(jié)優(yōu)選的提取沙果青果的工藝條件下，對沙果青果和熟果中多酚進(jìn)行提取，多酚得率分別為(7.875±0.008)和(10.259±0.020) mg/g。由數(shù)據(jù)可知，兩種不同樣品提取條件中，熟果提取時用的乙醇體積分?jǐn)?shù)(60%)雖略高于青果(50%)，但振蕩時間(30 min)卻低于青果(50 min)，在料液比相同和振蕩溫度相差不大的條件下，熟果多酚得率明顯高于青果，較之提升了30.27%。由此可見，采用水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚時，熟果中多酚含量高于青果，而且提取熟果多酚明顯縮短提取時間，降低能耗，提升效率，因此，熟果比青果更適宜作為沙果多酚提取的原料。

表2 沙果熟果多酚提取正交試驗結(jié)果

2.2 沙果熟果果籽多酚粗提

由于實際生產(chǎn)中熟果果籽易于分離且其中多酚含量豐富，為實現(xiàn)沙果熟果全果的資源化利用，提取沙果熟果果籽中的多酚，測定其多酚得率以實現(xiàn)沙果熟果的多酚最大化提取。按沙果熟果多酚的最優(yōu)提取方法進(jìn)行，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴振蕩時間30 min,料液比1 ∶25，水浴振蕩溫度40 ℃。實驗結(jié)果表明：沙果熟果果籽在此條件下進(jìn)行多酚提取時多酚得率為7.416 mg/g，低于沙果中的多酚(10.259 mg/g)，但也具有非常可觀的提取價值，在后續(xù)工業(yè)化提取多酚的過程中可省略除去果籽這一步驟，簡化工藝的同時提高多酚得率。

2.3 沙果多酚粗提物的分析與表征

采用水浴振蕩輔助乙醇提取法分別提取沙果青果多酚和熟果多酚，將綠原酸、(+)-兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、阿魏酸、根皮苷和根皮素的混合多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及最佳工藝條件下提取得到的2種沙果多酚進(jìn)行液相色譜分析[11-12]，通過液相色譜分析了2種方法提取的沙果多酚中酚組成，液相色譜圖見圖1(未去除溶劑峰和雜質(zhì))。

1.綠原酸chlorogenic acid; 2.(+)-兒茶素(+)-catechin; 3.原花青素B2 proanthocyanidin B2; 4.表兒茶素epicatechin;

從圖可以看出，水浴振蕩輔助乙醇提取法提取到的沙果青果多酚的組成與沙果熟果多酚組成基本相同，均主要含有4種多酚，分別是綠原酸、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷，阿魏酸和根皮素未檢出。而沙果熟果多酚中還檢出含有(+)- 兒茶素。

為得到上述沙果多酚含量，將綠原酸、(+)- 兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷的6個標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，以峰面積(y)對多酚質(zhì)量濃度(x，g/L)求得線性方程和相關(guān)系數(shù)(R2)，結(jié)果見表3。由表可知，5種組分的線性方程的R2均大于0.999，表明線性關(guān)系良好。

表3 多酚的線性方程、R2和線性范圍

由HPLC分析測試可知：沙果青果中綠原酸17.35 g/L(22.033 0%)，原花青素B26.989 g/L(8.875 00%)、表兒茶素4.686 g/L(5.950 0%)和根皮苷0.991 g/L(1.259 0%)。沙果熟果中綠原酸42.14 g/L(41.075 8%)，原花青素B25.787 g/L(5.641 3%)、表兒茶素8.541 g/L(8.325 2%)，根皮苷0.513 g/L(0.499 8%)和(+)- 兒茶素7.432 g/L(7.244 4%)。定量結(jié)果表明：無論是青果還是熟果，多酚占比最大的都是綠原酸，這可能是導(dǎo)致沙果獨(dú)特的酸爽口味的主要原因。青果中多酚占比最少的是根皮苷，熟果占比最少為根皮苷。青果中檢出的4種多酚占總多酚的38.117%，熟果中檢出的5種多酚占總多酚的62.786 5%，沙果中仍有大部分未知多酚未檢出。

液相色譜結(jié)果表明：利用水浴振蕩輔助乙醇提取法提取沙果多酚，沙果熟果比沙果青果的多酚種類更豐富。綠原酸、(+)- 兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷作為植物多酚[13]，對人體具有優(yōu)異的抗氧化[14]、抗衰老功效[15]，可有效預(yù)防由于氧化作用帶來的人體心腦血管的腫瘤[16]、皮膚的衰老、肌肉骨骼的退化[17]和腸道菌群失調(diào)[18]。尤其是綠原酸及其衍生物具有比抗壞血酸、咖啡酸和生育酚更強(qiáng)的自由基清除效果，可有效清除DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基，還可抑制低密度脂蛋白的氧化。綠原酸對有效地清除體內(nèi)自由基、維持機(jī)體細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能、防止和延緩腫瘤突變和衰老等現(xiàn)象的發(fā)生具有重要作用[19]。食用沙果熟果不僅風(fēng)味更佳，營養(yǎng)價值也高于青果。目前對于沙果中多酚成分的研究較為少見，采用環(huán)保安全且高效的水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚是一種理想的實驗方法。

3 結(jié) 論

3.1采用水浴振蕩輔助乙醇提取沙果青果和熟果多酚，通過正交試驗對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,得到水浴振蕩輔助乙醇提取沙果青果多酚最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1 ∶25(g ∶mL)，水浴振蕩時間50 min，水浴振蕩溫度30 ℃；提取沙果熟果多酚最佳提取工藝條件為料液比1 ∶25(g ∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴振蕩時間30 min，水浴振蕩溫度40 ℃。最佳提取工藝條件下熟果青果多酚含量為(7.875±0.008) mg/g，熟果多酚含量達(dá)到(10.259±0.020) mg/g。水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚時，沙果熟果多酚含量明顯高于沙果青果多酚含量。

3.2液相色譜分析表明：水浴振蕩輔助乙醇提取法所得沙果熟果和青果多酚的組成均主要含有4種多酚，且沙果熟果中還含有(+)-兒茶素。沙果青果中綠原酸17.35 g/L(22.033 0%)，原花青素B26.989 g/L(8.875 00%)、表兒茶素4.686 g/L(5.950 0%)和根皮苷0.991 g/L(1.259 0%)。沙果熟果中綠原酸42.14 g/L(41.075 8%)，原花青素B25.787 g/L(5.641 3%)、表兒茶素8.541 g/L(8.325 2%)，根皮苷0.513 g/L(0.499 8%)和(+)-兒茶素7.432 g/L(7.244 4%)。沙果熟果比沙果青果的多酚種類更豐富，含量更高。目前對于沙果中多酚成分的研究較為少見，采用環(huán)保安全且高效的水浴振蕩輔助乙醇提取沙果多酚是一種理想的實驗方法。