鄭宇翔 劉德國 徐天波 湯霄朕 范亮全 侯振海 鄭隆寶

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是最常見的關(guān)節(jié)疾病之一，其臨床特征是關(guān)節(jié)痛、夜間疼痛、功能障礙和活動受限[1-2]。OA發(fā)病機制尚未明確，機械損傷、代謝障礙及炎癥反應(yīng)等均會引發(fā)OA，疾病發(fā)展可導致持續(xù)疼痛甚至殘疾[3-5]。在OA的疾病進程中，軟骨細胞和滑膜細胞會過度產(chǎn)生可溶性炎癥介質(zhì)，因此抗感染療法可能為治療該病提供潛在可能[6]。胰升糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）是腸內(nèi)分泌 L 細胞產(chǎn)生的腸降血糖素激素，通過與胰高血糖素受體的靶向結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶誘導環(huán)狀單磷酸腺苷（cyclic adenosine 3',5'-monophosphate,cAMP）的產(chǎn)生，進而激活蛋白激酶A（protein kinase A,PKA），PKA激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP responsive element-binding protein,CREB），從而調(diào)節(jié)與炎癥相關(guān)基因的表達[7-9]。研究表明，CREB激動劑可以減少炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號傳導，從而保護軟骨細胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，抑制細胞凋亡和炎癥[10]。黃芪皂苷可以通過CREB的激活抑制神經(jīng)炎的發(fā)展，從而有效減輕坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型的痛溫覺過敏[11]。有關(guān)黃芪皂苷是否可在OA中發(fā)揮抗炎作用的研究較少。鑒于此，本研究初步探討黃芪皂苷對OA的治療作用及其潛在分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年雄性Wistar大鼠90只，體重200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗房，在（26±2）℃的環(huán)境溫度下飼養(yǎng)，光暗周期為12 h。大鼠自由飲食飲水。本實驗操作符合實驗動物3R原則。

1.2 主要試劑 GLP-1激動劑購自美國Novo Nordisk公司；單碘乙酸鹽（monoiodoacetate,MIA）購自美國Sigma-Aldrich 公司；兔抗 CREB、磷酸化 CREB（p-CREB）、PKA、磷酸化 PKA（p-PKA）、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 抗體均購自英國Abcam公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）及辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG均購自美國Proteintech公司；A/G瓊脂糖蛋白珠購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；免疫組化試劑盒購自美國Boster Biological Technology公司；黃芪皂苷購自上海源葉生物公司；Fusion-FX7系統(tǒng)購自法國Collégien公司；Image-Pro Plus 6.0軟件購自美國Media Cybernetics公司。

1.3 膝OA大鼠模型的建立及藥物干預

1.3.1 膝OA大鼠模型的建立 取60只Wistar大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、OA-1組、OA-5組、OA-10組、OA-20組和OA-28組，每組10只。所有大鼠均使用50 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)麻醉。對照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)單次注射40 μl 0.9%氯化鈉注射液；OA-1組、OA-5組、OA-10組、OA-20組和OA-28組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)單次注射4 mg MIA（溶于40 μl 0.9%氯化鈉注射液中），并在注射后第1、5、10、20和28天分別處死。檢測對照組、OA-1組、OA-5組、OA-10組、OA-20組和OA-28組大鼠模型軟骨組織中CREB的表達。MIA的注射操作步驟：麻醉大鼠后將其仰臥位固定在手術(shù)臺上，后腿右膝處剃毛并消毒，將4 mg MIA溶解于40 μl 0.9%氯化鈉注射液中，并通過髕下韌帶注射到右膝關(guān)節(jié)腔中，出針后用無菌紗布包扎放入籠中[12]。

1.3.2 藥物干預 取另外30只Wistar大鼠按照1.3.1的方法制備OA動物模型，并按照隨機數(shù)字表法分為OA組、OA+0.9%氯化鈉注射液組（下稱OA+生理鹽水組）和OA+黃芪皂苷組，每組10只。OA+黃芪皂苷組大鼠皮下注射0.5 ml/（kg·d）黃芪皂苷[13]（黃芪皂苷濃度：0.1 g/ml）；OA+生理鹽水組大鼠每天皮下注射0.5 ml 0.9%氯化鈉注射液；OA組大鼠不予任何藥物處理。OA+黃芪皂苷組和OA+生理鹽水組大鼠持續(xù)注射28 d后，無不良反應(yīng)發(fā)生。所有大鼠均使用50 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)麻醉后脫頸處死。獲得大鼠左膝關(guān)節(jié)標本，并迅速去除膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉。沿關(guān)節(jié)囊的股骨邊緣橫切去除股骨軟骨。此外，沿骨表面切開股骨和脛腓骨，縱向切開關(guān)節(jié)囊，并分離滑膜組織。然后將軟骨標本保存在液氮中備用。

1.4 PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白（PKA、p-PKA、CREB、p-CREB）、炎癥相關(guān)蛋白（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）表達水平檢測 采用Western blot法。用含焦磷酸鈉和蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液提取軟骨組織的總蛋白。采用雙辛可寧酸（BCA）試劑對蛋白質(zhì)濃度進行定量。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離收獲的蛋白質(zhì)或免疫沉淀物，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，置于封閉緩沖液中室溫孵育2 h后，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，5 min/次，隨后與山羊抗兔一抗（1∶1 000）稀釋液于4℃孵育過夜。用TBST洗滌3次（5 min/次）后，將膜與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶3 000）抗體孵育1 h。然后將膜用TBST洗滌3次，5 min/次，并通過增強化學發(fā)光（ECL）進行顯影。使用Fusion-FX7系統(tǒng)通過光密度掃描對印跡的吸光度進行定量，計算各基因與GAPDH的相對表達水平。

1.5 CREB表達水平檢測 采用免疫組化染色法。將一部分軟骨組織用于制備石蠟切片。3% H2O2封閉10 min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉 30 min后，將切片脫蠟并重新水化。然后，將切片與兔抗CREB（1∶50）在4℃孵育過夜，與山羊抗兔二抗室溫孵育30 min。將切片在PBS中洗滌，并置于3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液中孵育3 min。使用蘇木精復染細胞核。使用光學顯微鏡捕獲圖像并通過Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析，并使用吸光度積分值測量CREB的表達水平。每個標本至少使用3個切片測量CREB的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB表達水平比較 與對照組比較，OA-1組、OA-5組、OA-10組、OA-20組和OA-28組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB表達水平均降低（均P＜0.05）；免疫組化染色顯示，與對照組比較，OA-28組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB水平下調(diào)（P＜0.05），并且均值最低，見圖1。

圖1 OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB的表達比較（a：各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB表達的電泳圖；b：各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達定量柱狀圖，與對照組比較，*P＜0.05；c：免疫組化染色所見；d：各組免疫組化染色蛋白表達定量柱狀圖，與對照組比較，*P＜0.05）

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 與對照組比較，OA-1組、OA-5組、OA-10組、OA-20組和OA-28組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB和p-CREB蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較（a：各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB和p-CREB蛋白表達的電泳圖；b：各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB和p-CREB蛋白表達定量柱狀圖，與對照組比較，*P＜0.05）

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥相關(guān)蛋白表達水平比較 與對照組比較，OA-1組、OA-5組、OA-10組、OA-20組和OA-28組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-6、IL-6和IL-1β蛋白表達水平均增加（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥相關(guān)蛋白表達水平比較（a：各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達的電泳圖；b：各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達定量柱狀圖，與對照組比較，*P＜0.05）

2.4 黃芪皂苷對OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達的影響 OA組和OA+生理鹽水組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與OA+生理鹽水組比較，OA+黃芪皂苷組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達水平增加（P＜0.05），見圖4a-b。免疫組化染色定量分析結(jié)果與Western blot分析結(jié)果相一致，見圖4c-d。

圖4 黃芪皂苷對OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達的影響（a：3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達的電泳圖；b：3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB蛋白表達定量柱狀圖，與OA+生理鹽水組比較，*P＜0.05；c：免疫組化染色所見；d：3組免疫組化染色蛋白表達定量柱狀圖，與OA+生理鹽水組比較，*P＜0.05）

2.5 黃芪皂苷對OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA/CREB信號通路的調(diào)控 OA組和OA+生理鹽水組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與OA+生理鹽水組比較，OA+黃芪皂苷組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表達水平均增加（均 P＜0.05），見圖 5。

圖5 黃芪皂苷對OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA/CREB信號通路的調(diào)控（3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表達的電泳圖；b：3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表達定量柱狀圖，與OA+生理鹽水組比較，*P＜0.05）

2.6 黃芪皂苷對OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥的影響 OA組和OA+生理鹽水組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與OA+生理鹽水組比較，OA+黃芪皂苷組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），見圖6。

圖6 黃芪皂苷對OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥的影響（3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達的電泳圖；b：3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達定量柱狀圖，與OA+生理鹽水組比較，*P＜0.05）

3 討論

OA多見于中老年人，可以導致關(guān)節(jié)部位骨贅形成，髕下脂肪墊消失，從而損傷膝關(guān)節(jié)功能，嚴重時導致關(guān)節(jié)畸形，甚至致殘，嚴重影響我國中老年人群的健康[14]。目前，OA的臨床治療仍以西醫(yī)保守治療為主，抗炎鎮(zhèn)痛及關(guān)節(jié)活性物質(zhì)藥物使用雖然具有一定療效，但往往肝腎毒性較大，同時會刺激患者消化道[15]。中藥以其安全有效以及價格低廉等優(yōu)勢被越來越多的研究者關(guān)注，黃芪皂苷是中藥材黃芪根莖的有效成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、保護心血管、抗炎、抗纖維化、抗病毒及抗腫瘤作用[16]。目前有關(guān)黃芪皂苷對OA是否具有治療作用及其潛在機制鮮見報道。

研究表明，炎癥在OA的發(fā)展中起著重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)類風濕關(guān)節(jié)炎的早期和終末期滑膜組織中TNF-α、IL-6和IL-1β等細胞因子表達水平明顯變化[18-19]。本研究結(jié)果表明，OA大鼠模型軟骨組織中這些細胞因子的水平明顯增加，表明軟骨炎癥可能與OA的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，在OA的早期階段阻斷炎癥途徑，抑制過度的炎癥反應(yīng)可延緩或阻礙疾病的進展，為抗關(guān)節(jié)炎的藥物開發(fā)提供理論的基礎(chǔ)。

炎癥由多種上游和下游分子介導。研究發(fā)現(xiàn)PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白具有抗炎功能，可作為炎癥相關(guān)疾病治療靶標[20-21]。CREB與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶家族的成員CREB結(jié)合蛋白結(jié)合，并催化組蛋白乙?；?，從而將染色質(zhì)從閉合狀態(tài)轉(zhuǎn)換為開放狀態(tài)，促進RNA聚合酶Ⅱ和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子與開放DNA的結(jié)合，進而啟動包括炎癥細胞因子在內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，例如IL-10和雙重特異性磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1,DUSP1）[22-23]。IL-10可以將產(chǎn)生高水平促炎細胞因子和低水平抗炎細胞因子的M1“炎癥”表型的巨噬細胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生低水平促炎細胞因子和高水平的抗炎分子的M2b“調(diào)節(jié)”表型；糖皮質(zhì)激素誘導的DUSP1可以通過p38 MAPK和c-Jun N末端激酶（JNKs）的去磷酸化和失活抑制MyD88信號通路的激活，從而參與炎癥反應(yīng)[24-25]。近年來研究證實，PKA/CREB信號通路與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，第二信使cAMP可以通過PKA調(diào)節(jié) CREB的磷酸化，p-CREB抑制CRE轉(zhuǎn)錄因子的活性，進而抑制炎癥因子表達，抑制炎癥的發(fā)生?；罨腜KA/CREB信號通路還能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)保護相關(guān)蛋白的表達，在抑制神經(jīng)炎癥的同時發(fā)揮神經(jīng)保護作用[26-29]。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，MIA誘導的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CREB表達較低，且炎癥相關(guān)蛋白的上調(diào)伴隨著PKA/CREB信號通路的下調(diào)，提示PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白在OA的發(fā)展中具有潛在的重要作用。

綜上所述，在MIA誘導的OA大鼠模型中，CREB蛋白表達水平明顯降低，同時伴隨著PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白的下調(diào)和炎癥相關(guān)蛋白TNF-α、IL-6和IL-1β的上調(diào)，黃芪皂苷可以通過激活PKA/CREB信號通路，抑制炎癥相關(guān)蛋白的表達，進而發(fā)揮抗炎活性。