錢新月 陳麗花 周泉 沈文艷 莫娟芬 王宙政 韓艷霞 張東凱 張斌忠 胡蓓莉

B細胞淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤的一種，其異質(zhì)性很強，療效差別很大。甲狀腺激素受體相互作用因子 13（thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13）是一種AAA-ATP酶，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用[1]。腫瘤的發(fā)生往往從DNA損傷開始，TRIP13可重塑希爾丁復合物——一種DNA損傷修復相關(guān)的重要物質(zhì)，從而干擾損傷DNA的修復，導致腫瘤的發(fā)生[2]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13不但與肺癌、膠質(zhì)瘤、腎癌的發(fā)病有關(guān)[3-4]，而且在惰性B細胞淋巴瘤中也有表達[5]。因此，本研究探討TRIP13在B細胞淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年9月至2020年11月在嘉興市第二醫(yī)院就診后進行淋巴結(jié)活檢，并留取多余的新鮮淋巴結(jié)活檢組織凍存的B細胞淋巴瘤患者44例為研究對象，其中男23例，女21例；年齡44～83（66.09±9.64）歲。所有患者病理學診斷結(jié)果均為B細胞淋巴瘤。所有患者活檢前均未接受任何化療、放療或生物學治療；經(jīng)病理確診后按照臨床指南規(guī)范診治，接受標準化療至少2個療程。參照2016年WHO對B細胞淋巴瘤分型診斷標準，將44例患者分為惰性淋巴瘤組（包括3a級及以下的濾泡淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、小B細胞淋巴瘤、惰性套細胞淋巴瘤）20例和侵襲性淋巴瘤組（包括3b級濾泡淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤、經(jīng)典型套細胞淋巴瘤、高級別B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤）24例。本研究經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 Trizol試劑購自美國Sigma公司；PrimeScriptRTMaster Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Fast qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司；TRIP13 antibody試劑購自美國GeneTex公司；二抗山羊抗兔IgG（H+L）、HRP試劑均購自北京康為世紀生物科技有限公司；NanoDrop分光光度儀購自美國Thermo Scientific公司；ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；Axio LabA1顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.3 TRIP13 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。使用Trizol試劑提取淋巴結(jié)活檢組織RNA，并使用NanoDrop分光光度儀檢測RNA濃度。按照Prime－ScriptRTMaster Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書所述方法，在冰上配制10 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應液，37℃ 15 min，85℃5 s，4℃結(jié)束反應。反應結(jié)束后按照SYBR Fast qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒說明在冰上配制20 μl反應體系。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，引物序列由上海生工科技生物公司合成。GAPDH上游引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，下游引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；TRIP13 上游引物：5'-TGCAGCAAATCACTGGGTTCT-3'， 下 游 引 物 ：5'-GGTTCCAGGTGATGAGGTTGC-3'。將逆轉(zhuǎn)錄反應液與反應體系輕輕混勻后放置在ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀上。PCR擴增標準程序：95℃預變性30 s；PCR反應：95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應結(jié)束確認熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達量。

1.4 TRIP13蛋白表達檢測 采用En Vison免疫組化染色法。淋巴瘤組織石蠟切片脫蠟至水。3%過氧化氫室溫孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3遍后PBS浸泡，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育后棄血清。滴加一抗工作液，4℃過夜。洗滌，滴加二抗，37℃孵育30 min。洗滌，滴加適量辣根酶，37℃孵育30 min。洗滌，滴加顯色劑顯色。在Axio LabA1顯微鏡下，每張切片隨機選取至少4個不同高倍視野（×400），每個視野計數(shù)200個腫瘤細胞。陽性細胞的胞質(zhì)或胞核著色，淡黃色為弱染色，棕黃色為中度染色，棕褐色為強染色。無染色為0，＜25%的腫瘤細胞呈弱染色為1+，25%～50%的腫瘤細胞呈中度染色為2+，＞50%～100%的腫瘤細胞呈強染色為3+。根據(jù)TRIP13免疫組化表達情況，將B細胞淋巴瘤患者分為TRIP13陰性組（0）和TRIP13陽性組（≥1+），比較兩組患者的臨床特征；再根據(jù)TRIP13免疫組化表達強度，將TRIP13陽性患者分為TRIP13弱陽性組（1+）和TRIP13強陽性組（≥2+），比較兩組患者的臨床特征。

1.5 臨床資料收集 收集所有患者性別、年齡、B細胞淋巴瘤分型情況、增殖指數(shù)（Ki-67）、乳酸脫氫酶、β2微球蛋白、白蛋白水平、外周血淋巴細胞計數(shù)、外周血淋巴細胞亞群指標包括T淋巴細胞比例、T輔助細胞比例、T抑制細胞比例、B細胞比例、NK細胞比例、活化CD4+細胞比例、活化CD8+細胞比例及CD4+/CD8+。按照《美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)B細胞淋巴瘤治療指南》規(guī)范治療2個療程后采用Lugarno評估標準評估療效[6]，統(tǒng)計2個療程達完全緩解（complete response,CR）及未達CR的例數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 惰性淋巴瘤組和侵襲性淋巴瘤組TRIP13 mRNA表達水平比較 惰性淋巴瘤組和侵襲性淋巴瘤組TRIP13 mRNA表達水平分別為0.37（0.17，1.36）和0.69（0.28，1.15），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=-0.141，P＞0.05）。

2.2 B細胞淋巴瘤患者TRIP13蛋白表達情況分析免疫組化染色顯示，TRIP13可表達于淋巴瘤細胞的細胞核中，也可表達于淋巴瘤細胞的胞質(zhì)中。根據(jù)TRIP13 免疫組化表達情況，分為 0、1+、2+、3+四個等級，見圖1（插頁）。TRIP13免疫組化為0者12例，1+者20例，2+者9例，3+者3例。

2.3 不同TRIP13免疫組化表達強度B細胞淋巴瘤患者的臨床特征比較

2.3.1 TRIP13陰性組和TRIP13陽性組患者臨床特征比較 44例B細胞淋巴瘤患者中，TRIP13陰性組12例，TRIP13陽性組 32例。TRIP13陽性組患者TRIP13 mRNA表達水平、Ki-67水平及活化CD8+細胞比例均高于TRIP13陰性組，T輔助細胞比例、活化CD4+細胞比例、CD4+/CD8+均低于TRIP13陰性組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。而兩組患者性別、年齡、B細胞淋巴瘤分型、乳酸脫氫酶水平、β2微球蛋白水平、白蛋白水平、外周血淋巴細胞計數(shù)、T淋巴細胞比例、T抑制細胞比例、B細胞比例、NK細胞比例、2個療程達CR例數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 TRIP13陰性組和TRIP13陽性組患者臨床特征比較

2.3.2 TRIP13弱陽性組和TRIP13強陽性組患者臨床特征比較 32例TRIP13陽性患者中，TRIP13弱陽性組20例，TRIP13強陽性組12例。TRIP13弱陽性組患者TRIP13 mRNA表達水平、Ki-67水平、活化CD8+細胞比例均低于TRIP13強陽性組，活化CD4+細胞比例、CD4+/CD8+均高于TRIP13強陽性組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。而兩組患者性別、年齡、B細胞淋巴瘤分型、乳酸脫氫酶水平、β2微球蛋白水平、白蛋白水平、外周血淋巴細胞計數(shù)、T淋巴細胞比例、T輔助細胞比例、T抑制細胞比例、B細胞比例、NK細胞比例、2個療程達CR例數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（均 P＞0.05），見表 2。

表2 TRIP13弱陽性組和TRIP13強陽性組患者臨床特征比較

3 討論

TRIP13作為一種新型的有絲分裂檢查點沉默蛋白，是一種AAA-ATP酶。它與亞基閉合型有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（closed mitotic arrest deficiency protein 2,c-Mad2）結(jié)合能夠?qū)е掠薪z分裂檢查點復合物（mitotic checkpoint complex,MCC）的失活，從而導致姐妹染色單體錯誤分離[7]。

本研究結(jié)果顯示，免疫組化TRIP13陰性組和陽性組之間、TRIP13弱陽性組和強陽性組患者之間TRIP13 mRNA表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義，提示免疫組化法測定TRIP13在淋巴瘤組織中的表達情況與使用RT-PCR方法檢測組織中TRIP13的mRNA水平具有較好的一致性，免疫組化法測定TIRP13的表達情況一定程度上可以反映其組織中的基因水平。在臨床特征上，本研究結(jié)果顯示，TRIP13陽性組和陰性組相比、TRIP13強陽性組與弱陽性組相比，具有更高的Ki-67水平，提示TRIP13的表達與B細胞淋巴瘤的癌細胞具有更高增殖速度存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。這和實體瘤的研究結(jié)果一致，即染色體不穩(wěn)定是癌細胞產(chǎn)生的遺傳學機制，TRIP13過表達觸發(fā)有絲分裂檢查點過早的沉默可能促進癌癥發(fā)展及腫瘤細胞的增殖[8]。這一點已在很多實體瘤中被證實[9-12]。在血液系統(tǒng)腫瘤中，TRIP13是高危多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）中過度表達的 70個基因之一[13]，也是構(gòu)成 MM染色體不穩(wěn)定性特征的10個基因之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在T細胞淋巴瘤中，蕈樣真菌病腫瘤組織中TIRP13表達水平高于對照組[15]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TRIP13的免疫組化情況和淋巴細胞亞群有關(guān)。TRIP13陽性組和陰性組相比、TRIP13強陽性組與弱陽性組相比，活化CD4+細胞比例更低，活化CD8+細胞比例更高。以往研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細胞數(shù)越低，CD8+T淋巴細胞數(shù)越高，分期越晚，預后越差[16]。提示細胞免疫與B細胞淋巴瘤的進展有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，彌漫大B細胞淋巴瘤患者外周血淋巴細胞亞群具有更低的CD4+T細胞比例和更高的CD8+T細胞比例[17]?？赡芎土馨土龅陌l(fā)生過程中，淋巴細胞亞群發(fā)生應激性變化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13表達強度不但與淋巴瘤細胞Ki-67水平有關(guān)，而且與T淋巴細胞亞群的應激性反應程度有關(guān)。TRIP13陽性組和陰性組相比、TRIP13強陽性組與弱陽性組相比，T細胞免疫應激情況更紊亂。研究發(fā)現(xiàn)在MM中，CD4+細胞比例、CD4+/CD8+下降，也提示存在免疫紊亂[18]，和本研究結(jié)果相符。但在膠質(zhì)瘤中，與低 TRIP13水平腫瘤組織相比，高TRIP13水平腫瘤組織CD8+T細胞特異性基因與調(diào)節(jié)性 T細胞特異性基因mRNA水平降低[19]，似乎和本研究不符。這可能與膠質(zhì)瘤和淋巴瘤在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中細胞免疫反應存在一定差異有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)TRIP13陰性組和TRIP13陽性組、TRIP13弱陽性組和TRIP13強陽性組患者2個療程達CR例數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義。雖然有研究表明TRIP13可激活Akt信號通路，導致包括MAD在內(nèi)的蛋白質(zhì)的泛素化、磷酸化和降解，從而導致腫瘤的化學抗藥性[20]，但本研究結(jié)果并未反映這一點，考慮可能與樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，本研究采用免疫組化法分析B細胞淋巴瘤組織中TRIP13蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)TRIP13蛋白表達水平與mRNA水平一致，且TRIP13陽性及強陽性與更高的Ki-67水平、活化CD8+細胞比例及更低的活化CD4+細胞比例有關(guān)。提示TRIP13陽性可能和腫瘤細胞增殖及免疫調(diào)控異常等發(fā)病機制有關(guān)。