陸文鵬 陳 民 董小耘
肺癌常年居于我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率和病死率首位,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是其中最常見(jiàn)的類(lèi)型,約占原發(fā)性肺癌的85%[1]。中醫(yī)認(rèn)為,肺癌病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí),病位在肺,與肝、脾、腎關(guān)系密切[2]。小陷胸湯由黃連、半夏、瓜蔞組成,黃連苦寒,能泄熱除痞,半夏辛溫,可化痰散結(jié),降逆水飲;三藥合用可清熱化痰散結(jié),熊繼柏教授曾應(yīng)用小陷胸湯加減治療肺癌肝火犯肺、痰熱壅盛之證,并取得較好的療效[3]。臨床應(yīng)用當(dāng)把握其“痰熱互結(jié)”的病機(jī),運(yùn)用異病同治,可緩解多種心胸、脅下、胃脘不適疾病[4]。研究表明,小陷胸湯抗腫瘤的作用主要機(jī)制有:抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬,阻滯腫瘤細(xì)胞周期,抑制腫瘤血管生成,調(diào)節(jié)免疫抑制腫瘤微環(huán)境等[5]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù),獲取有關(guān)NSCLC 患者跟正常人肺組織細(xì)胞的芯片,分析兩者中存在基因表達(dá)的差異,篩選小陷胸湯的主要活性成分,并探究其對(duì)NSCLC 的作用靶點(diǎn)及生物通路,以期進(jìn)一步闡明小陷胸湯緩解NSCLC 的可能作用機(jī)制。
1.1 NSCLC 差異基因篩選 利用NCBI 子網(wǎng)站GEO數(shù)據(jù)庫(kù),以“non-small cell lung cancer”為檢索詞,通過(guò)篩選,下載其相關(guān)GSE、GPL 平臺(tái)文件,使用R軟件利用“packages”“pheatmap”及“Limma”包以lgFC>1(FC 表示差異倍數(shù))、矯正后P 值<0.05 為條件篩選出差異表達(dá)基因,并導(dǎo)出文件,后利用ggplot2包繪制差異基因火山圖;pheatmap 包繪制差異基因的熱圖。
1.2 小陷胸湯藥物成分及靶點(diǎn)篩選 以O(shè)B≥30%,DL≥0.18 為有效活性成分篩選條件,在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選,獲取黃連、半夏、瓜蔞3 味中藥有效成分。結(jié)合TCMSP 中Relate Targets 的文件得到有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),再通過(guò)uniprot 注釋文件,將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因ID。
1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將1.1 中的NSCLC 靶點(diǎn)與1.2 中小陷胸湯潛在藥物靶點(diǎn)繪制韋恩圖,得到小陷胸湯與NSCLC 的共同靶點(diǎn),將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.2,同時(shí)將上述“1.2”獲得的活性成分及靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。
1.4 蛋白互作與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)。再利用Cytoscape 3.8.2 軟件對(duì)PPI 信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化,并對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,篩選出核心靶點(diǎn)。
1.5 靶點(diǎn)通路分析 利用Bioconductor 平臺(tái)將靶點(diǎn)基因ID 轉(zhuǎn)化為entrez ID。通過(guò)R 軟中相關(guān)Bioconductor 安裝包,設(shè)置P=0.05、Q=0.05 進(jìn)行GO 富集分析,保存富集結(jié)果并選取生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)各自前10 位繪圖。同樣方法進(jìn)行KEGG 分析,再利用Cytoscape3.8.2 軟件進(jìn)行KEGG 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。
1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到的關(guān)鍵靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)“.pdb”格式文件,在PubChem中得到小陷胸湯中對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的化合物的2D 結(jié)構(gòu),并導(dǎo)入Chem3D 軟件得到優(yōu)化后的3D 結(jié)構(gòu);通過(guò)SYBYL-X 2.0 軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白去水、加氫、計(jì)算電荷等處理,再導(dǎo)入化合物3D 結(jié)構(gòu),使用Surflex-Dock 模塊對(duì)藥物小分子和靶蛋白受體進(jìn)行分子對(duì)接分析。根據(jù)Total-Score 打分函數(shù)對(duì)活性成分與靶標(biāo)蛋白相互作用進(jìn)行評(píng)分,Total-Score 值愈大,說(shuō)明小分子化合物與大分子蛋白的匹配結(jié)合作用越好。以Total-Score>5 為閾值,進(jìn)行繪圖。
2.1 肺癌疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取GSE1987 數(shù)據(jù)集,所采用的平臺(tái)為GPL91,共有9例正常人樣本及28 例NSCLC 患者樣本。共篩選出差異表達(dá)基因520 個(gè),其中上調(diào)基因200 個(gè)、下調(diào)基因320 個(gè)。熱圖(見(jiàn)圖1)中橫坐標(biāo)是樣本名稱(chēng)(正常對(duì)照組在前,腫瘤組在后),縱坐標(biāo)為基因名稱(chēng)。表達(dá)程度由低到高用綠色、黑色、紅色標(biāo)注。如差異基因MMP1 在腫瘤組高表達(dá),在正常對(duì)照組為低表達(dá)。火山圖(見(jiàn)圖2)中,橫坐標(biāo)中l(wèi)ogFC>1 時(shí),表示在腫瘤組上調(diào);logFC<-1 時(shí),表示在腫瘤組下調(diào)。
圖1 正常對(duì)照組與非小細(xì)胞腫瘤患者差異基因熱圖
圖2 正常對(duì)照組與非小細(xì)胞腫瘤患者差異基因火山圖注:黑色為在正常對(duì)照組與腫瘤組無(wú)差異基因;綠色為在正常對(duì)照組上調(diào),在腫瘤組下調(diào);紅色為在正常對(duì)照組下調(diào),在腫瘤組上調(diào)
2.2 藥物成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索藥物的成分,篩選后得到有效成分:黃連14個(gè),半夏13 個(gè),瓜蔞11 個(gè),見(jiàn)表1。結(jié)合Relate Targets 文件得到184 個(gè)靶點(diǎn)基因。
表1 藥物成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果
2.3 小陷胸湯緩解NSCLC 活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將小陷胸湯與NSCLC 差異基因取交集后,得到交集Venn 圖(見(jiàn)圖3)及交集數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2,繪制分子基因網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4)。共得到潛在基因靶點(diǎn)20 個(gè),對(duì)應(yīng)的有效成分19 個(gè)。其中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較多的是黃連的活性成分槲皮素(對(duì)應(yīng)16個(gè)靶點(diǎn)),其次是半夏的活性成分松柏苷和卡維?。ǜ鲗?duì)應(yīng)4 個(gè)靶點(diǎn));對(duì)應(yīng)活性成分較多的靶點(diǎn)ADRB2(對(duì)應(yīng)10 個(gè)活性成分)、NR3C2 和F10(分別對(duì)應(yīng)7 個(gè)活性成分)可能為小陷胸湯緩解NSCLC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
圖3 小陷胸湯與非小細(xì)胞肺癌Venn 圖
圖4 小陷胸湯對(duì)非小細(xì)胞肺癌作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖
2.4 小陷胸湯緩解NSCLC 基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖 將上一步所得20 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置置信度為Highest≥0.9,并剔除獨(dú)立于網(wǎng)絡(luò)以外的靶點(diǎn),獲取PPI 相關(guān)信息,可得到PPI 圖(見(jiàn)圖5),利用Cytoscape3.8.2 軟件對(duì)PPI 信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化,并對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行ClosenessDegree、Betweenness、Eigenvector 算法拓?fù)浞治稣页雒總€(gè)條件大于中位值的基因,并進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖6)。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖中,有20 個(gè)節(jié)點(diǎn),202 條邊,其中黃色基因位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置為關(guān)鍵基因,其算法拓?fù)浞治鲋袀€(gè)數(shù)值均大于中位數(shù),在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。
圖5 小陷胸湯緩解非小細(xì)胞肺癌基因的PPI 圖
圖6 小陷胸湯緩解非小細(xì)胞肺癌基因的蛋白拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖
2.5 靶點(diǎn)通路分析 使用R 軟件對(duì)小陷胸湯治療胃癌的基因進(jìn)行GO 富集分析(見(jiàn)圖7)。靶點(diǎn)顯著富集于對(duì)類(lèi)固醇、多細(xì)胞生物過(guò)程、對(duì)金屬離子的反應(yīng)等生物過(guò)程;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)蛋白激酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等細(xì)胞組成;絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸型水解酶活性等分子功能。
圖7 GO 富集分析氣泡圖
使用R 軟件,進(jìn)行KEGG 富集分析,共富集到11 條通路關(guān)系(見(jiàn)圖8)。將KEGG 的11 條通路導(dǎo)入Cytoscape3.8.2。根據(jù)degree 值大小,顯示通路與基因的富集程度,繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖9)。其中液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(5 個(gè)靶點(diǎn)、13.5%)、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGERAGE)信號(hào)通路(4 個(gè)靶點(diǎn)10.8%)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(4 個(gè)靶點(diǎn)10.8%)、細(xì)胞衰老(4 個(gè)靶點(diǎn)10.8%)、p53 信號(hào)通路(3 個(gè)靶點(diǎn)8.1%)、IL-17 信號(hào)通路(3 個(gè)靶點(diǎn)8.1%)、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(3 個(gè)靶點(diǎn)8.1%)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(3 個(gè)靶點(diǎn)8.1%)、細(xì)胞周期(3 個(gè)靶點(diǎn)8.1%)、松弛素信號(hào)通路(3 個(gè)靶點(diǎn)8.1%)、膀胱癌(2 個(gè)靶點(diǎn)5.4%)等,對(duì)應(yīng)的MMP9、CCL2、CDK1、CCNB1、MMP1、SELE 基因數(shù)目較多。
2.8 分子對(duì)接結(jié)果 將核心靶點(diǎn)CCL2、CAV1、IGFBP3、MMP9、SPP1、MMP1 與其對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接分析,其中CAV1、IGFBP3 在uniprot 中未找到合適的蛋白結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)計(jì)算Total-Score>5 的有槲皮素與靶點(diǎn)MMP1(1HFC)以及槲皮素與靶點(diǎn)SPP1(3CXD)。見(jiàn)圖10。
圖10 槲皮素與MMP1(1HFC)及SPP1(3CXD)分子對(duì)接模型
NSCLC 發(fā)病隱匿,胸部CT 作為早期篩查方案在我國(guó)常規(guī)體檢中并未完全普及,導(dǎo)致約有70%的NSCLC 患者確診時(shí)已是晚期[6]。目前治療多采用靶向治療、免疫治療和含鉑類(lèi)雙藥化療等全身治療為主的綜合治療模式[7],但這些藥物的使用對(duì)患者身體狀況要求較高。而中醫(yī)多作為輔助療法,能減輕西藥的不良反應(yīng)、增加治療效果、延緩病情進(jìn)展,以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間,改善患者生活質(zhì)量[8]。
本研究共篩選出小陷胸湯有效成分38 個(gè),其中作用最顯著的是槲皮素,其余成分還有松柏苷、卡維丁、β-谷甾醇、小檗堿等。槲皮素為黃酮類(lèi)化合物,其有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[9]。槲皮素可抑制肺癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移、促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡、增加各項(xiàng)治療的敏感性,對(duì)肺癌裸鼠動(dòng)物移植瘤也有明顯的抑制作用[10]。槲皮素能夠增強(qiáng)LAP3 基因沉默抗NSCLSC 中A549 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用,抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[11]。松柏苷抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與其有抗炎[12]、抗氧化[13]的作用相關(guān)。卡維丁能明顯抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和NO 生成[14],這是否是其抗腫瘤的機(jī)制可進(jìn)一步研究。β-谷甾醇可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡性死亡[15]。小檗堿可通過(guò)調(diào)控Hedgehog 信號(hào)通路抑制肺癌干細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡[16]。小檗堿在NSCLSC 化療中能協(xié)同降低p-STAT3 及其下游信號(hào)分子HIF-1α 和cyclin D1 的表達(dá)以增加化療敏感性[17]。氧化小檗堿通過(guò)下調(diào)Src-FAK-Ras-Raf-MEK-ERK 通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖,從而達(dá)到抗NSCLC 的作用[18]。
根據(jù)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖,MMP9、CAV1、MMP1、SPP1、CCL2、IGFBP3 可能是小陷胸湯緩解NSCLC 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。MMP9 可作為NSCLC 診斷的潛在生物標(biāo)志物[19],其與腫瘤細(xì)胞的侵襲性有關(guān)[20]。CCL2 能增強(qiáng)炎癥單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等特定細(xì)胞類(lèi)型的抗腫瘤能力[21]。IGFBP3 是胰島素生長(zhǎng)調(diào)控結(jié)合蛋白,其能阻斷癌細(xì)胞膜上糖蛋白配體,從而避免癌細(xì)胞內(nèi)第二信使激活,癌細(xì)胞增殖活性降低,升高IGFBP3 蛋白水平,能夠增加NSCLC 一線化療方案的敏感性[22]。根據(jù)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)所得NSCLC 基因熱圖,可見(jiàn)MMP1、SPP1 為NSCLC 高表達(dá)蛋白。
GO 富集分析顯示,小陷胸湯可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)緩解NSCLC。根據(jù)KEGG 通路分析,小陷胸湯治療NSCLC 主要涉及11 條通路,主要通路為糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路等。AGERAGE 信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)有關(guān),該通路可以調(diào)節(jié)炎癥增殖階段發(fā)展[23],有學(xué)者在探索薤白治療肺癌過(guò)程中發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE 信號(hào)通路是治療肺癌的重要通路之一,并繪制了AGE-RAGE 信號(hào)通路圖[24]。p53是目前較明確的與腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因,有研究表明肺癌與p53 表達(dá)水平有一定相關(guān)性[25]。抑制p53 信號(hào)通路可以抑制A549 細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡從而緩解NSCLS[26]。此外有研究表明,抑制通過(guò)該通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑,對(duì)損傷的心肌、神經(jīng)元有一定保護(hù)作用[27-28],這些在肺癌的治療過(guò)程中能緩解他臟并發(fā)癥。IL-17 高表達(dá)是肺癌患者無(wú)病生存的危險(xiǎn)因素[29],抑制IL-17 信號(hào)通路持續(xù)活化能有效調(diào)節(jié)腫瘤遷徙微環(huán)境,起到緩解肺癌的作用[30]。TNF 通路與多種免疫性疾病相關(guān),TNF 是一種促炎因子,其在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤均有明顯的抑制和殺傷作用[31],TNF-α 可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物之一[32]。肺癌治療中,激活TNF-α 通路可促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖和遷移能力[33]。松弛素為內(nèi)源性肺保護(hù)因子,可減輕肺纖維化,抑制氣道重塑[34]。
綜上所述,本研究為小陷胸湯中有效成分,通過(guò)聯(lián)合GEO 差異分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探究了小陷胸湯在NSCLC 治療中的作用機(jī)制,為小陷胸湯緩解NSCLC 提供了新的參考依據(jù),但本研究仍存在一定局限性,相關(guān)作用靶點(diǎn)及通路仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。