黃業(yè)倫 劉志輝 張?jiān)毫?康曉明 林媛 吳碧彤 蔡杏珊

廣州市胸科醫(yī)院呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510095）

微生物是人類密不可分的“伙伴”，人體口腔、呼吸道、皮膚、胃腸道、泌尿生殖道等存在大量的微生物，總數(shù)可達(dá)10 萬億～100 萬億，微生物群對(duì)人體有營養(yǎng)作用、參與人體的代謝作用、對(duì)外來微生物有“生物拮抗”作用、有免疫屏障與免疫刺激作用，對(duì)機(jī)體的生長發(fā)育和衰老有重要作用，長期與機(jī)體處于動(dòng)態(tài)平衡中。不少研究表明慢性呼吸道疾病的菌群屏障功能受損，外源性病原體大量侵入或內(nèi)源性病原體大量生長，微生態(tài)失衡與疾病相關(guān)［1-3］。肺結(jié)核?。╬ulmonary tuberculosis，PTB）是一種古老的呼吸道傳染病，病原菌是外來的結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB），MTB 從呼吸道入侵到肺部定植，引起一系列的人體免疫反應(yīng)，包括免疫細(xì)胞的聚集吞噬、炎癥損傷、黏液分泌、纖毛清除作用、局部溫度、氧含量、pH 值等變化，以及對(duì)呼吸道的微生態(tài)的影響。為此，本項(xiàng)目采用培養(yǎng)方法探討初治肺結(jié)核患者呼吸道分泌物的細(xì)菌、真菌的微生態(tài)變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2019年至2020年到本院就診的70 名結(jié)核病初治患者作為觀察組，38 名健康醫(yī)務(wù)人員及醫(yī)學(xué)院學(xué)生作為對(duì)照組。兩組的年齡均為20～60 歲，觀察組男48 例，女22 例；對(duì)照組男20例，女18例。觀察組患者痰涂片找抗酸桿菌陽性，Gene Xpert MTB/RIF 核酸檢測鑒定為MTB，入組時(shí)未使用抗結(jié)核治療，后期的痰培養(yǎng)鑒定為MTB。觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病、惡性腫瘤等；（2）理解能力有限或不能配合檢查者。對(duì)照組無呼吸系統(tǒng)慢性疾病史，無心、肺、腦及其他疾病，X 線胸透無異常。所有受試對(duì)象均知情同意。

1.2 試劑與儀器MS 質(zhì)譜儀購于法國梅里埃公司；質(zhì)譜使用基質(zhì)液、甲酸、乙腈購自梅里埃公司，血平板、麥康凱平板、巧克力平板、科瑪嘉真菌顯色平板購自廣州市迪景公司，羅氏培養(yǎng)基購自珠海貝索公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 留取檢測標(biāo)本采用吸入超聲霧化3%鹽水的方法留取38 例對(duì)照組人群的呼吸道誘導(dǎo)痰，另外分別采集70 位TB 患者在初治期的清晨深呼吸痰。

1.3.2 細(xì)菌與真菌的培養(yǎng)

1.3.2.1 普通細(xì)菌與真菌培養(yǎng)采用5 μL 接種環(huán)分別挑取一環(huán)痰標(biāo)本接種在血平板、巧克力平板、麥康凱平板、科瑪嘉真菌顯色平板進(jìn)行4 區(qū)劃板半定量需氧、厭氧、真菌培養(yǎng)［4］。

1.3.2.2 分枝桿菌培養(yǎng)加入2 mL 痰液與4 mL 4%氫氧化鈉震蕩混勻，靜止15 min 后吸取0.2 mL混懸液接種到羅氏培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)［5］。

1.3.3 菌種鑒定培養(yǎng)陽性菌株根據(jù)平板上菌落的大小、凹凸形態(tài)、干燥或濕潤程度、黏稠程度，溶血程度，以及利用選擇培養(yǎng)基的菌落的不同顏色、菌落邊緣的不同形態(tài)進(jìn)行初步判斷，然后分類挑取單個(gè)菌落采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectromentry，MALDI-TOF MS）進(jìn)行菌種鑒定。具體操作見生物梅里埃公司的MALDITOF MS 說明書。

1.3.4 菌落密度計(jì)數(shù)對(duì)鑒定出來的菌種：普通細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌按4 區(qū)劃線標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)數(shù)：只在平板上第一區(qū)生長，菌落數(shù)為：104CFU/mL；能在第二區(qū)生長，且該區(qū)菌落數(shù)小于5，菌落數(shù)為：105CFU/mL；能在第三區(qū)生長，且該區(qū)菌落數(shù)小于5，菌落數(shù)為：106CFU/mL；能在第三區(qū)生長，且該區(qū)菌落數(shù)大于5，菌落數(shù)為：107CFU/mL。分枝桿菌的菌落計(jì)數(shù)為：培養(yǎng)基上的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)15。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0 對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，細(xì)菌密度數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并以log 10 換算出來表示，正態(tài)分布計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布資料秩和檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)計(jì)算，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 門水平的細(xì)菌及真菌檢出情況觀察組70份呼吸道樣本與對(duì)照組38 份呼吸道樣本分別培養(yǎng)，在門的水平上，兩組人群主要檢出細(xì)菌的五大菌門：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門，另檢出真菌的子囊菌門和擔(dān)子菌門（擔(dān)子菌門檢出菌株少于1%，不納入計(jì)算）。觀察組在放線菌門的檢出率比對(duì)照組低，在子囊菌門的檢出率比對(duì)照組高（P＜0.05）；從菌群的密度來看，觀察組在厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門的細(xì)菌密度比HG 高，在梭桿菌門的密度比HG 低，經(jīng)T 檢驗(yàn)計(jì)算差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1-2（觀察組在放線菌門的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)剔除結(jié)核分枝桿菌病原菌）。

表1 按”門”分析觀察組和對(duì)照組氣道細(xì)菌與真菌微生物檢出情況Tab.1 Detection in Phylumof bacteria and fungi in airway of 70 patients with tuberculosis and 38 healthy persons例（%）

2.2 種水平與屬水平的微生物檢出情況本次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)出67 個(gè)菌種，其中兩檢測組共同檢出菌種有32 種，觀察組獨(dú)有26 種，對(duì)照組獨(dú)有9 種，觀察組與對(duì)照組單獨(dú)檢出菌種的檢出率均低于25%。對(duì)于任一組檢出率大于50%的菌株：口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、奈瑟菌、小韋榮球菌/不典型韋榮球菌、粘滑羅斯菌、副流桿嗜血桿菌、產(chǎn)黑色素普雷沃菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌和口腔纖毛菌，以上菌種在觀察組和對(duì)照組的檢出率分別為：95.71%vs.100%、91.43%vs.100%、61.43%vs.71.05%、60.00%vs.86.84%、58.57%vs.94.74%、45.71vs.68.42%、38.57%vs.60.53%和44.29%vs.57.89%，是兩實(shí)驗(yàn)組共同的優(yōu)勢菌種，見表3、4。

表2 按”門”分析觀察組和對(duì)照組氣道細(xì)菌與真菌密度情況Tab.2 Colony forming unitin Phylumof bacteria and fungi in airway of 70 patients with tuberculosis and 38 healthy persons ±s

表2 按”門”分析觀察組和對(duì)照組氣道細(xì)菌與真菌密度情況Tab.2 Colony forming unitin Phylumof bacteria and fungi in airway of 70 patients with tuberculosis and 38 healthy persons ±s

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值擬桿菌門5.48±5.62 5.78±5.12 1.175 0.261厚壁菌門6.81±6.65 6.29±6.45-2.338 0.021變形菌門6.41±5.74 6.56±6.63 1.176 0.243放線菌門5.5±5.65 5.09±5.16-2.388 0.024梭桿菌門4.79±4.68 5.33±5.50 2.104 0.033子囊菌門6.01±5.85 3.4±3.53-2.835 0.007

表3 依檢出樣本比例按菌種分析結(jié)核病患者（TB）和健康組（HG）氣道細(xì)菌與真菌微生物檢出情況Tab.3 Detection rate in Speciesof bacteria and fungi in Airways of patients with tuberculosis and healthy people 例

3 討論

結(jié)核病是呼吸道慢性傳染病，2020年，全球有150 萬例因此死亡［6］，引起PTB 發(fā)生的病原菌已經(jīng)明確是MTB，但MTB 入侵肺部所引起的呼吸道微生態(tài)變化并未明確。本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)PTB 初治組與健康組檢出細(xì)菌的五大菌門：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門，另檢出真菌的子囊菌門和擔(dān)子菌門，是呼吸道的常見菌門，與多數(shù)研究一致［7-9］。

觀察組在放線菌門的檢出率比對(duì)照組低22.1%，主要是羅斯菌屬的檢出率降低。羅斯菌屬為呼吸道的正常菌群，在健康人的呼吸道中與其它菌屬構(gòu)成呼吸道的生物膜物理屏障，占據(jù)黏膜位置拮抗外來致病菌，PTB 患者因機(jī)體對(duì)MTB清除的免疫機(jī)制誤傷正常菌群，不少的研究也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)現(xiàn)象［8］。觀察組在子囊菌門的檢出率比對(duì)照組高38.5%，主要是酵母樣菌和絲狀真菌的升高。在結(jié)核病合并感染的許多研究中發(fā)現(xiàn)，由于MTB 在肺中形成肉芽腫，進(jìn)而破壞肺組織形成空洞或肺損傷利于真菌的定植［10］。

從菌群密度來看，觀察組在厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門的細(xì)菌密度比HG 高，在梭桿菌門的密度比HG 低。這表明結(jié)核病患者呼吸道菌群的生長繁殖相對(duì)于健康人群發(fā)生了變化。不少的研究也證實(shí)了PTB 患者呼吸道菌群紊亂，相對(duì)豐度發(fā)生變化［1，7-9，11］。

表4 結(jié)核病患者（TB）與健康組（HG）氣道細(xì)菌與真菌微生態(tài)構(gòu)成比較Tab.4 Comparison of microecological composition of bacteria and fungi in respiratory tract between patients with tuberculosis and healthy people

兩檢測組共同檢出32 種菌種，檢出率大于25%的菌種都屬于共同檢出菌，特別是檢出率大于50%的菌種，如口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、奈瑟菌、小韋榮球菌/不典型韋榮球菌、粘滑羅斯菌、副流感嗜血桿菌等均為口咽部延續(xù)到下呼吸道的常見優(yōu)勢菌種，與CHEUNG 等［11］及SUNG 等［12］團(tuán)隊(duì)的研究相近，也表明了PTB 的發(fā)生沒有影響呼吸道優(yōu)勢菌。

觀察組單獨(dú)檢出26 種菌種，對(duì)照組獨(dú)有9 種，數(shù)據(jù)表明觀察組的呼吸道菌群比健康人群有更多的多樣性，表現(xiàn)在觀察組檢出特有的非結(jié)核分枝桿菌及絲狀真菌，且檢出更多的條件致病菌，有一定的合并感染危險(xiǎn)性，與CUI 等［8］的報(bào)道結(jié)果相近。但也有研究［11］表明兩者的多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，估計(jì)與研究的人群、地域、環(huán)境等因素的不同相關(guān)。檢出率低于25%的菌種，屬于難以培養(yǎng)的呼吸道菌群以及本來就少量存在的條件致病菌，如腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵菌、金黃色葡萄球菌、非結(jié)核分枝桿菌、酵母樣菌、絲狀真菌菌等，觀察組培養(yǎng)出47 個(gè)菌種，對(duì)照組培養(yǎng)出30 個(gè)菌種，再次表明觀察組菌群的多樣性增加。

呼吸道菌群包括細(xì)菌、真菌、病毒，在正常情況下與人體互惠互利，菌群及其代謝產(chǎn)物參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、微量元素補(bǔ)充等，同時(shí)有防御致病菌入侵的功能。不少的研究表明呼吸道菌群紊亂與PTB 有關(guān)［1，7-9，11］。本文的數(shù)據(jù)同樣發(fā)現(xiàn)PTB 患者呼吸道菌群紊亂，條件致病菌菌種增多，部分正常菌群被拮抗減少。據(jù)此推測：當(dāng)機(jī)體免疫功能異常時(shí)，機(jī)體對(duì)外來菌的清除能力下降，打破了微生物遷入與清除的平衡，呼吸道的pH 值、氧含量、溫度、營養(yǎng)等發(fā)生了改變，外來菌更適宜生長繁殖，而且對(duì)定植的正常菌群起到拮抗作用，與此同時(shí)，機(jī)體對(duì)外來菌強(qiáng)烈的免疫清除作用也對(duì)正常菌群造成損傷，反之亦然。綜上所述，PTB 的發(fā)生不僅僅與MTB 病原菌有關(guān)，呼吸道的菌群種類、密度變化與機(jī)體的免疫反應(yīng)也參與了這個(gè)過程的發(fā)生，在后續(xù)的抗結(jié)核治療當(dāng)中，董文雅［13］發(fā)現(xiàn)HRZE 治療可改變肺結(jié)核患者痰液菌群的整體多樣性及菌群結(jié)構(gòu)，所以在快速有效殺滅MTB 菌的同時(shí)，應(yīng)關(guān)注呼吸道菌群的變化，以免引起細(xì)菌與真菌的合并感染。

本文的研究存在局限性，呼吸道的微生物種類繁多，僅僅采用有限的幾種培養(yǎng)基孵育細(xì)菌真菌，尚有部分菌屬不能培養(yǎng)出來，且在挑選菌落時(shí)有些偏倚，未能全面檢出菌屬。但是結(jié)合需氧、厭氧、真菌和分枝桿菌培養(yǎng)等多種方式孵育菌株，MALDI-TOF 技術(shù)鑒定，雖然無法媲美于16s rRNA和ITS 測序法的海量菌種，但也能培養(yǎng)出呼吸道的常見優(yōu)勢菌種，同時(shí)篩選出條件致病菌和病原菌，這是測序法無法比擬的［14］，直觀、肉眼可見的菌落和試劑成本低也是培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)［12］。

本文的研究尚未全面，且研究的數(shù)量也未足夠大，在后續(xù)的研究中將加大樣本量在各種類菌屬密度上以及在代謝與免疫應(yīng)答方面深入研究，探索微生態(tài)的奧秘，為PTB 的防治提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。