王晨倩 王桂榮 姜廣路 霍鳳敏 薛毅 黃海榮 段鴻飛

1首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院結核科（北京 101149）；2首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，北京市結核病胸部腫瘤研究所，國家結核病臨床實驗室，北京市耐藥結核病研究重點實驗室（北京 101149）

非結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）系指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的統(tǒng)稱［1］。NTM 病是指由NTM 感染引起的肺病及肺外疾病。近年來，NTM 病在全球范圍內(nèi)呈快速增長趨勢［2］，其中，包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的鳥分枝桿菌復合群（Mycobacteriun aviumcomplex，MAC）在絕大多數(shù)國家地區(qū)是引起NTM 病最常見的病原體［3］。目前指南［1］推薦MAC 肺病的標準治療方案是以大環(huán)內(nèi)酯類藥物（克拉霉素或阿奇霉素）為核心，聯(lián)合利福平（或利福布汀）、乙胺丁醇和阿米卡星，但Meta 分析顯示其治愈率很低，僅有60%～69%［4-6］。因此，尋找標準治療方案之外的高效抗MAC 藥物迫在眉睫。

近年來，氯法齊明（clofazimine，CFZ）、貝達喹啉（bedaquiline，BDQ）和德拉馬尼（delamanid，DLM）這三種藥物對NTM 展現(xiàn)出了較好的抑菌活性而備受矚目，但我國關于MAC 對這三種藥物敏感性的報道較少。因此，本研究通過比較分析氯法齊明、貝達喹啉和德拉馬尼對MAC 臨床分離株的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），初步評估其對MAC 肺病的治療價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株93 株試驗菌株均收集于首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院國家結核病臨床實驗室樣本庫，其中胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株81 株，鳥分枝桿菌臨床分離株12 株。菌株自患者呼吸道標本中分離出來，可以在含有對硝基苯甲酸的中性改良羅氏培養(yǎng)基（珠海銀科醫(yī)學工程股份有限公司）上生長的細菌初步鑒定為NTM，之后通過在Gen-Bank 分析比對同源序列16S rRNA 編碼基因、熱休克蛋白65（hsp65）編碼基因、16S-23S rRNA 基因間區(qū)（ITS）和RNA 聚合酶β 亞基（rpoB）鑒定至種水平。實驗使用的標準菌株為ATCC13950（胞內(nèi)分枝桿菌標準株）和ATCC25291（鳥分枝桿菌標準株）。

1.1.2 抗感染藥物及溶劑氯法齊明（上海瀚香生物科技有限公司）、貝達喹啉（上海瀚香生物科技有限公司）、德拉馬尼（上海瀚香生物科技有限公司），均由二甲基亞砜（美國Sigma 公司）作為溶劑，分別配置成濃度為4 mg/mL、4 mg/mL、16 mg/mL的藥液。

1.2 方法

1.2.1 MIC 測定采用微孔板Alamar Blue 法（microplate alamar blue assay，MABA）。選取在中性改良羅氏培養(yǎng)基上生長3～4 周的新鮮菌落，磨菌，將菌懸液比濁至0.5McFarland，再用MH 培養(yǎng)基將0.5McFarland 的菌懸液稀釋至（1～5）×105CFU/mL備用。在96孔板每孔加入100 μL的MH培養(yǎng)基，在第12 列加入稀釋好的藥物（貝達喹啉1 μg/mL、氯法齊明4 μg/mL、德拉馬尼鳥分枝桿菌16 μg/mL、德拉馬尼胞內(nèi)分枝桿菌2.048 mg/mL），吹打混勻后由第12 列吸出100 μL 至下一列吹打混勻，以此類推倍比稀釋至第2 列，將最后100 μL 棄掉。最后向每孔加入備好的菌液100 μL。此時，第一列為不加藥物只有菌液和培養(yǎng)基的對照孔，第12 列為最高藥物濃度（貝達喹啉0.25 μg/mL、氯法齊明1 μg/mL、德拉馬尼鳥分枝桿菌4 μg/mL、德拉馬尼胞內(nèi)分枝桿菌512 μg/mL）。將96孔板放置于37 ℃溫箱孵育9～10 d后，在每孔加入20 μL Alamar blue和50 μL 5% Tween80，37 ℃孵育24 h 后讀取結果。如液體顏色變?yōu)榉奂t色則表明有菌落生長，為藍色則表明無菌落生長，按相應孔顏色的變化讀取實驗結果并記錄。

1.2.2 流行病學臨界值（ECOFF）的確定使用ecoffinder-xl-2010-v21-webversion 軟件（美國臨床和實驗室標準協(xié)會CLSI）計算相應的MIC50、MIC90及ECOFF 值。

2 結果

2.1 氯法齊明對MAC 的MIC 和ECOFF 值氯法齊明對胞內(nèi)分枝桿菌的MIC 范圍分布廣，為0.015 6～0.5 μg/mL，MIC50和MIC90分別為0.25 μg/mL和0.5 μg/mL，ECOFF 值為0.5 μg/mL（表1，圖1）；氯法齊明對鳥分枝桿菌的MIC50和MIC90分別為0.25 μg/mL 和0.5 μg/mL，ECOFF 值為0.5 μg/mL（表1，圖2）。

圖1 氯法齊明對胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株的MIC 值分布Fig.1 The MIC distribution of clofazimine against M.intracellulare clinical isolates

圖2 氯法齊明對鳥分枝桿菌臨床分離株的MIC 值分布Fig.2 The MIC distribution of clofazimine against M.avium clinical isolates

表1 氯法齊明和貝達喹啉對MAC 臨床分離株的MICTab.1 The MICs of clofazimine and bedaquiline against MAC clinical isolates μg/mL

2.2 貝達喹啉對MAC的MIC和ECOFF值貝達喹啉對胞內(nèi)分枝桿菌的MIC范圍分布廣，為0.007 8～0.25 μg/mL，MIC50和MIC90分別為0.125 μg/mL和0.25 μg/mL，ECOFF值為0.25 μg/mL（表1，圖3）；貝達喹啉對鳥分枝桿菌的MIC 范圍為0.015 6～0.062 5 μg/mL，75%（9/12）的鳥分枝桿菌的MIC 均為0.062 5 μg/mL，MIC 為0.015 6 和0.031 3 μg/mL的胞內(nèi)分枝桿菌分別有1 和2 株（表1，圖4）。

圖3 貝達喹啉對胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株的MIC 值分布Fig.3 The MIC distribution of bedaquiline against M.intracellulare clinical isolates

圖4 貝達喹啉對鳥分枝桿菌臨床分離株的MIC 值分布Fig.4 The MIC distribution of bedaquiline against M.avium clinical isolates

2.3 德拉馬尼對MAC的MIC德拉馬尼對胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌的MIC 均較高：91.7%（11/12）的鳥分枝桿菌的MIC 均為＞4 μg/mL，MIC 為≤0.004 μg/mL 的胞內(nèi)分枝桿菌僅有1 株；97.5%（79/81）的胞內(nèi)分枝桿菌的MIC ≥256 μg/mL，MIC 為≤0.5 μg/mL 和4 μg/mL 的胞內(nèi)分枝桿菌各有1 株。

3 討論

雖然指南推薦了MAC 肺病的標準治療方案，但有一些因素影響了治療效果，導致治愈率較低。一是如果患者使用濃度受利福霉素影響的藥物，會影響基礎疾病的治療。高齡是NTM 肺病的易感因素，且高齡NTM 肺病患者合并心腦血管基礎疾病的人數(shù)也較多，而MAC 肺病標準治療方案中的利福霉素是肝藥酶P450 強誘導劑，會降低抗凝藥（如利伐沙班）、降壓藥（如氨氯地平）和降糖藥（如格列齊特）的藥物濃度［7-9］。二是高齡患者使用阿米卡星存在較高的腎毒性和耳毒性風險。三是既往抗結核治療史影響MAC 肺病的療效。在我國，肺結核為常見病，而MAC 肺病實驗室檢查也可以發(fā)現(xiàn)抗酸染色陽性和分枝桿菌培養(yǎng)陽性，導致一部分MAC 肺病患者在確診前已經(jīng)接受了抗結核治療，予MAC 肺病標準方案可能形成事實上大環(huán)內(nèi)酯單藥治療MAC 肺病，造成治療失敗。因此，有必要探索新的MAC 肺病治療藥物。

MAC 對多數(shù)抗分枝桿菌藥物耐藥的原因之一在于其細胞壁為疏水性，藥物不易透過。但氯法齊明為親脂性化合物，可以自由透過MAC 的細胞壁，破壞細菌的細胞壁［10］。氯法齊明通過與分枝桿菌DNA 結合抑制RNA 聚合酶，阻止RNA 合成，進而抑制蛋白質的合成發(fā)揮抗菌作用。體外試驗顯示氯法齊明對MAC有良好抑菌效果。KWAK 等［11］的研究顯示氯法齊明對MAC 的MIC 分布范圍廣，為0.031～8 mg/L。KIM等［12］研究顯示，氯法齊明對鳥分枝桿菌的MIC50和MIC90分別為0.125 μg/mL 和0.25 μg/mL，對胞內(nèi)分枝桿菌的MIC50和MIC90均為0.25 μg/mL。在LUO 等［13］研究中，鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株的氯法齊明ECOFF 值分別為1 μg/mL 和2 μg/mL。HUANG 等［14］研究結果指出，氯法齊明對鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的MIC 范圍分別為1～4 mg/L、≤0.25～8 mg/L。此外，體外實驗還顯示氯法齊明與阿米卡星、克拉霉素、利奈唑胺、乙胺丁醇和貝達喹啉具有協(xié)同作用［15-19］。臨床研究顯示，大環(huán)內(nèi)酯聯(lián)合氯法齊明治愈率高于大環(huán)內(nèi)酯聯(lián)合利福平治愈率（100%vs.71%，P=0.000 2）［20］。

貝達喹啉是一種新型二芳基喹啉類口服抗生素，可以選擇性抑制ATP合酶質子泵以干擾能量產(chǎn)生，使ATP 耗竭，導致細胞死亡而發(fā)揮殺菌作用［21］。在LITVINOV 等［21］的研究中，貝達喹啉對鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的MIC50、MIC90、ECOFF值分別為0.015、0.12、0.12 μg/mL 和0.007、0.06 、0.06 μg/mL。KIM 等［22］研究顯示，貝達喹啉對MAC臨床分離株的MIC50和MIC90均為≤0.016 μg/mL。PANG 等［23］研究指出，貝達喹啉對鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的MIC50均為0.03 μg/mL，ECOFF均為1 μg/mL。SONI 等［24］的研究結果顯示，貝達喹啉對鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的MIC 范圍分別為0.03～0.13 μg/mL 和0.03～0.25 μg/mL。

與以上研究相比，本研究中氯法齊明對MAC的MIC 偏低，貝達喹啉對MAC 的MIC 則偏高，這可能是由于地域差異和實驗方法的不同引起的。比如HUANG等［14］、KWAK等［11］和LITVINOV等［21］收集的菌株分別是來自中國臺灣、韓國和俄羅斯地區(qū)，而本研究中的菌株主要來源于中國北方地區(qū)。SONI 等［24］采用的是瓊脂稀釋法，而本實驗采用的是肉湯稀釋法。

與氯法齊明和貝達喹啉相比，德拉馬尼對MAC 無明顯抑制作用。KIM 等［22］研究指出，德拉馬尼對MAC 的MIC 值很高，對鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的MIC50分別為8 μg/mL 和16 μg/mL，對MAC 的MIC90均為＞16 μg/mL。在YU 等［25］的研究中，德拉馬尼對94.4%（34/36）胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株的MIC ≥32 μg/mL。而在本研究中，德拉馬尼對胞內(nèi)分枝桿菌的MIC 更高，97.5%（79/81）胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株MIC ≥256 μg/mL，造成這一差異的原因可能是藥敏試驗中設置的藥物最高濃度不同，在本實驗中，胞內(nèi)分枝桿菌的德拉馬尼藥物濃度范圍是0.5～512 μg/mL，最高濃度遠高于以往試驗。

本研究存在如下局限性：最主要的是鳥分枝桿菌臨床分離株的樣本量過小，可能會導致結果出現(xiàn)偏差。其次，鑒于在MAC 臨床分離株收集前，患者均未使用過貝達喹啉、氯法齊明及德拉馬尼，所以暫時認為這批菌株均為“野生型”。但是，在確定MAC 藥敏試驗的臨界值時，還應該包括已經(jīng)暴露于給定藥物的菌株，而本研究中未收集該類菌株，也會導致獲得的臨界值不能完全代表廣泛的MAC 菌株。

盡管本研究結果顯示出MAC 對氯法齊明、貝達喹啉在體外有較高的敏感性，但在藥代和藥動學方面的研究不夠充足，藥物之間的相互作用也未深入研究。因此，如何將氯法齊明、貝達喹啉更好地用于MAC 肺病的治療，還需要進一步的研究。