王楠 鄧麗 牛群 吳玲 雷杰 謝貝 楊瑜 李華 劉志輝 孟繁榮

廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所（廣州 510095）

吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）可殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)或微酸性環(huán)境中非復(fù)制性結(jié)核分枝桿菌，在耐藥和敏感結(jié)核患者抗結(jié)核治療中均發(fā)揮了重要作用。PZA 發(fā)揮抗結(jié)核作用需要酸性環(huán)境［1-2］（pH 5.5），而結(jié)核分枝桿菌最適生長(zhǎng)pH 為6.5～6.8。有研究表明［3］與pH 6.8 相比，在pH 5.5 的酸性環(huán)境中有50%以上的結(jié)核菌生長(zhǎng)受到抑制，有些菌株則根本不能生長(zhǎng)。鑒于此結(jié)核菌體外PZA 藥敏試驗(yàn)的敏感性和特異性有限，不及其他抗結(jié)核藥物成熟。目前MGIT 960 分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)是WHO認(rèn)可的PZA 敏感性的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。而該方法所需儀器設(shè)備、試劑昂貴難以在基層全面開(kāi)展，也因此關(guān)于結(jié)核分枝桿菌PZA 藥敏性的信息不及其他一線抗結(jié)核藥物全面。我院自2012年開(kāi)展MGIT 960 PZA 藥敏試驗(yàn)，約60%以上的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者接受PZA 藥敏檢測(cè)。對(duì)就診于本院結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥狀況分析發(fā)現(xiàn)，其他一線抗結(jié)核藥物組合耐藥可能影響結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率?；诖耍狙芯糠治隽?012-2018年就診于我院結(jié)核患者的PZA 耐藥特征，旨在了解本地區(qū)PZA 耐藥結(jié)核病的流行狀況，進(jìn)一步探討可能影響結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥的重要因素，為結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥機(jī)制的揭示提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料分枝桿菌生物樣本信息庫(kù)中選取PZA 和異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素（以下分別簡(jiǎn)稱為H、R、E、S）藥敏信息齊全的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，菌株分離自2012年11月至2018年12月就診于我院的結(jié)核患者。菌株包括H、R、E和S 全部敏感菌株5 752 株，及對(duì)上述四種藥物中任意一種及以上耐藥的菌株3 574 株。

1.2 分組依據(jù)結(jié)核分枝桿菌對(duì)H、R、E 和S 耐藥數(shù)量的不同分為4 組：耐1 藥（1 372 例）、耐2 藥（865 例）、耐3 藥（797 例）和耐4 藥（540 例）；依據(jù)結(jié)核分枝桿菌是否出現(xiàn)R耐藥分為R耐藥（791例）和R 敏感（1 008 例）組；依據(jù)結(jié)核分枝桿菌對(duì)H、R、E 和S 耐藥組合不同分為16 組：Q（5 752 例）、S（731 例）、H（440 例）、E（66 例）、R（135 例）、SE（14 例）、RS（50 例）、HS（423 例）、RE（16 例）、HR（327 例）、HE（35 例）、HSE（66 例）、RSE（8 例）、HRS（552 例）、HRE（171 例）、HRSE（540 例）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以Excel 表格公式計(jì)算不同耐藥組合結(jié)核分枝桿菌的PZA 耐藥率；以SPSS 26.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析比較一線抗結(jié)核藥物耐藥組合不同及利福平耐藥特征不同的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株P(guān)ZA 耐藥率差異，以P＜0.05/n（n 為組間比較次數(shù)）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐0、1、2、3、4 種藥物結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率及其組間差異比較耐0、1、2、3、4 種其他一線抗結(jié)核藥物結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率結(jié)果示，任意兩組組間PZA 耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。見(jiàn)表1。

表1 一線抗結(jié)核藥物耐藥數(shù)量不同結(jié)核分枝桿菌的PZA 耐藥率Tab.1 PZA resistance rates of MTB with resistance to different numbers of first-line drugs

2.2 利福平（RFP）耐藥和RFP 敏感結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率及其組間差異比較RFP 耐藥和敏感的結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率為分別為56.03%和12.51%，兩組PZA 耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RFP 耐藥耐1（RFPR1）、2（RFPR2）、3（RFPR3）、4（RFPR4）種藥物及RFP 敏感耐1（RFPS1）、2（RFPS2）、3（RFPS3）種藥物結(jié)核分枝桿菌的PZA 耐藥率比較，7 組結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率差異顯示：RFPR1與RFPS2、RFPR2與RFPS3、RFPR3與RFPS3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.002），余者任意兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.002）。見(jiàn)表2。

表2 RFP 耐藥表型不同結(jié)核菌的PZA 耐藥率Tab.2 PZA resistance rates of MTB with different RFP resistance phenotypes

2.3 H、R、S、E 的16 種耐藥組合結(jié)核分枝桿菌的PZA 耐藥率及組間差異比較H、R、E 和S 的16種耐藥表型組合耐藥菌與全敏菌組間PZA 耐藥率差異顯示：S、E、SE 耐藥菌與全敏菌的PZA 耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.003），余者組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.003）。見(jiàn)表3。

表3 一線抗結(jié)核藥物耐藥組合不同結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率Tab.3 PZA resistance rates of MTB with different backgrounds of resistance to first-line anti-tuberculosis drugs

3 討論

PZA 作為目前唯一可殺滅非復(fù)制性持留菌的抗結(jié)核藥物，與RFP 和INH 聯(lián)合在縮短抗結(jié)核治療療程及耐藥和敏感結(jié)核治療中均發(fā)揮了重要作用［4-7］。受限于PZA 發(fā)揮抗結(jié)核作用需要微酸性環(huán)境（pH 約為5.5），加之其藥敏性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法難以普及，因此對(duì)結(jié)核患者的PZA 耐藥狀況的了解不如其他幾種一線抗結(jié)核藥物全面深入。我院自2012年以來(lái)應(yīng)用MGIT 960 分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)開(kāi)展結(jié)核分枝桿菌PZA 藥敏檢測(cè)，基于此，本研究分析了2012-2018年間就診于我院結(jié)核患者中有PZA 藥敏信息者的PZA 耐藥特征，旨在了解本地區(qū)PZA 耐藥結(jié)核病流行狀況、分析可能影響結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥的主要因素，為結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥機(jī)制的進(jìn)一步闡明提供研究基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)南方地區(qū)結(jié)核患者總體PZA耐藥率約為15.51%，與其他結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家PZA耐藥率相近［8-10］，我國(guó)2010年結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查也顯示PZA 耐藥率約為15%［11］。而德國(guó)和韓國(guó)結(jié)核患者PZA耐藥率則分別為1.6%和3.1%［12-13］，可見(jiàn)不同國(guó)家地區(qū)PZA耐藥結(jié)核病流行狀況不同。但耐多藥結(jié)核患者中PZA 耐藥者的流行狀況普遍較為嚴(yán)峻：目前全球超過(guò)50%的耐多藥結(jié)核患者對(duì)PZA 耐藥［14］。不同國(guó)家和地區(qū)略有不同：非洲［15］（54%）、印度［16］（57.8%）、秘魯［17］（47.7%）、韓國(guó)［18］（35.7%）、重慶［19］（62.4%）、杭州［20］（55%）、河南［21］（69.08%），本地區(qū)耐多藥結(jié)核患者PZA 耐藥率為60.69%。在非耐多藥結(jié)核患者中PZA 耐藥狀況不同國(guó)家地區(qū)亦有所不同，巴基斯坦、烏干達(dá)、坦桑尼亞結(jié)核患者PZA 耐藥率分別為14.8%［8］、21%［9］、20%［10］，本地區(qū)非耐多藥結(jié)核患者PZA 耐藥率為6.22%。

耐多藥結(jié)核患者PZA 耐藥率普遍高于非耐多藥者，而超過(guò)90%的利福平耐藥者為耐多藥。眾所周知，結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因編碼RNA 聚合酶β 亞基，其突變影響利福平與其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合從而產(chǎn)生耐藥。RNA 聚合酶在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯中發(fā)揮重要作用，可能會(huì)影響結(jié)核分枝桿菌的代謝。PZA 為前體藥物，其發(fā)揮抗結(jié)核作用需要PZA 酶催化為活性形式吡嗪酸。PZA 酶是PZA 發(fā)揮抗結(jié)核作用中重要的蛋白，rpoB 基因突變導(dǎo)致的RNA 聚合酶β 亞基改變是否會(huì)影響到PZA 酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)利福平耐藥結(jié)核患者的PZA 耐藥率顯著高于利福平敏感者，由此猜想，利福平耐藥可能從影響PZA 酶的轉(zhuǎn)錄翻譯方面對(duì)結(jié)核分枝桿菌的PZA 耐藥產(chǎn)生影響。以此科學(xué)假說(shuō)指導(dǎo)后續(xù)PZA 耐藥機(jī)制的研究，如有所發(fā)現(xiàn)或可為結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥機(jī)制的全面揭示提供理論基礎(chǔ)。此外RFP 耐藥結(jié)核菌中隨著其他抗結(jié)核藥物耐藥數(shù)量的增多PZA 耐藥率顯著升高，PZA 耐藥率的這種變化是否與一線抗結(jié)核藥物組合耐藥相關(guān)需要進(jìn)一步的研究予以探索。

對(duì)其他抗結(jié)核藥物耐藥對(duì)結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥的影響分析發(fā)現(xiàn)：一線抗結(jié)核藥物耐藥組合不同的結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥率不同，與KHAN等［22］和CHE 等［23］研究相似。此外，S 和E 單獨(dú)及同時(shí)耐藥菌與全敏菌的PZA 耐藥率均無(wú)顯著差異，提示此兩種藥物可能并非影響結(jié)核分枝桿菌PZA 耐藥的主要因素。與本研究不同，LIN 等［24］研究發(fā)現(xiàn)在福建PZA 耐藥結(jié)核菌中S 和E 耐藥率明顯較高。本研究發(fā)現(xiàn)利福平和異煙肼單獨(dú)耐藥結(jié)核菌之間PZA 耐藥率無(wú)顯著差異，兩者是否共同影響結(jié)核菌PZA 耐藥需要進(jìn)一步探索研究。鑒于SE、RE 和RSE 耐藥菌株均不足20 株，本研究的分析尚不足以確定S 和E 是否會(huì)與利福平或異煙肼聯(lián)合影響結(jié)核菌PZA 耐藥。

綜上分析，利福平和異煙肼可能是影響本地區(qū)結(jié)核菌PZA 耐藥的主要因素。關(guān)于我國(guó)南方地區(qū)結(jié)核菌的PZA 耐藥，HAMEED 等［25］在2020年已有報(bào)道。其研究針對(duì)耐多藥結(jié)核患者探討PZA 耐藥基因突變特征，本研究與其不同。本研究尚存在不足：其一，進(jìn)行分枝桿菌藥敏檢測(cè)結(jié)核患者中僅60%檢測(cè)了PZA 的藥敏性，本研究報(bào)道的本地區(qū)PZA 結(jié)核病流行狀況可能與真實(shí)狀況不同；其二，RSE 耐藥菌株僅有8 株，其PZA 耐藥率為50%是否能真實(shí)反映所有RSE 耐藥結(jié)核患者的PZA 耐藥率需要繼續(xù)研究探討；其三，納入研究的結(jié)核患者缺乏明確的抗結(jié)核藥物治療信息，給全面深入的PZA 耐藥影響因素的分析帶來(lái)困難，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究將予以深入探討。本研究在表型耐藥特征方面發(fā)現(xiàn)了利福平和異煙肼耐藥可能是影響結(jié)核菌PZA 耐藥的主要因素，而兩者耐藥是否在分子水平上對(duì)結(jié)核菌PZA 耐藥產(chǎn)生影響需要進(jìn)一步深入研究。