張婷 曾建偉 戴雨婷 吳廣文 陳俊

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福州 350122；3 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州 350122）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是關(guān)節(jié)炎最常見的形式，也是全球慢性疼痛和殘疾的主要來源，特別是膝骨關(guān)節(jié)炎，且其為退行性病變，患病率隨著年齡的增長而增加。OA 系由創(chuàng)傷、肥胖等諸多因素引起的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生[1]。按照國家中醫(yī)藥管理局制定的中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[2]，OA 屬于骨痹范疇。臨床上以患病關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬、活動受限為最常見癥狀[3]。中醫(yī)藥在OA的防治方面具有一定優(yōu)勢[4]。結(jié)合現(xiàn)代研究[5～7]OA 證候分類可分為腎虛髓虧、風(fēng)寒濕阻、瘀血阻滯、痰瘀互結(jié)等證型。由于所處朝代靠后及診療對象地位特殊，一些學(xué)者認(rèn)為清代御醫(yī)博通經(jīng)籍，其在辨證論治、選方用藥方面經(jīng)驗(yàn)豐富且嚴(yán)謹(jǐn)慎重、竭心盡力，療效往往較為顯著[8～10]。清宮系列書籍由國醫(yī)大師陳可冀院士主編。筆者以該書為基礎(chǔ)，收集其治療OA的方劑，利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，整理、分析清宮治療OA 的用藥規(guī)律及組方規(guī)律，以期為清宮系列書籍治療OA 外用方劑的挖掘和傳承工作提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 原始資料采集 研究方劑來源于陳可冀主編之清宮系列書籍：《清宮醫(yī)案集成》《清宮配方集成》《慈禧光緒醫(yī)方選議》《清宮膏方精華》《清宮醫(yī)案精選》《清宮醫(yī)案研究》《清代宮廷醫(yī)學(xué)精華》《清宮外治醫(yī)方精華》。根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局制定的骨關(guān)節(jié)炎診療標(biāo)準(zhǔn)[2]，采集其主治涉及“腰膝等關(guān)節(jié)隱隱疼痛、屈伸、轉(zhuǎn)側(cè)不利、筋骨疼痛、腳膝拘攣、骨節(jié)僵硬、筋骨不舒”等病癥的方劑。

1.2 資料數(shù)據(jù)預(yù)處理 根據(jù)本研究挖掘目標(biāo)，采用的預(yù)處理方法包括數(shù)據(jù)整理、變換，即統(tǒng)一規(guī)范中藥名稱、簡約分割冗雜方劑[11]。對一些名稱不完整的中藥予以剔除，名稱完整中藥參照《中藥學(xué)》[12]教材將中藥名進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，形成標(biāo)準(zhǔn)名稱，如懷牛膝、懷膝、牛膝統(tǒng)一規(guī)范為牛膝，川獨(dú)活、獨(dú)活統(tǒng)一規(guī)范為獨(dú)活等。

1.3 數(shù)據(jù)挖掘方法 采用Excel 建立數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括具體方劑名、中藥名稱。運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)（V3.0）軟件（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供）統(tǒng)計(jì)每味藥物的使用頻數(shù)，并進(jìn)一步分析其功效、性味、歸經(jīng)。基于此進(jìn)行用藥關(guān)聯(lián)分析和聚類分析，研究其用藥規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻次、性味、歸經(jīng)及功效統(tǒng)計(jì)結(jié)果 共收錄方劑103 首，涉及中藥439 味。439 味中藥共出現(xiàn)1 232 次，其中出現(xiàn)頻次≥10 次的中藥共21 味，占總藥味數(shù)的4.78%。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來看，中藥使用頻次在前10 位的是：乳香、當(dāng)歸、沒藥、防風(fēng)、木瓜、紅花、羌活、獨(dú)活、白芷、川芎。見表1。對中藥進(jìn)行功效、性味、歸經(jīng)分析，功效頻次在前4 位的是活血化瘀類、祛風(fēng)濕類、解表類、補(bǔ)虛類；使用性溫、平，味辛、苦藥物的頻次較多，藥物歸經(jīng)以肝、脾經(jīng)為主。見表2～表3。

表1 醫(yī)案處方中頻次較高的藥物

續(xù)表

表3 頻次≥10 的中藥性味情況（次）

2.1.1 醫(yī)案處方中藥物的四氣分布 參照《中藥學(xué)》[12]教材對高頻中藥藥性進(jìn)行歸納、統(tǒng)計(jì)和分析。高頻中藥以性溫為主，占比50%，其次為性平，占比23%。見圖1。

圖1 藥性圖

2.1.2 醫(yī)案處方中藥物的五味分布 參照《中藥學(xué)》[12]教材對高頻中藥藥味進(jìn)行歸納、統(tǒng)計(jì)和分析。結(jié)果顯示高頻中藥以味苦、辛為主，分別占比37%和37%，其次為味甘，占比18%。見圖2。

圖2 藥味圖

2.1.3 醫(yī)案處方中藥物的歸經(jīng)分布 參照《中藥學(xué)》[12]教材對高頻中藥歸經(jīng)進(jìn)行歸納、統(tǒng)計(jì)和分析。若一味中藥有多個(gè)歸經(jīng)，則全部統(tǒng)計(jì)在內(nèi)，結(jié)果顯示，藥物歸經(jīng)以肝經(jīng)（24%）、脾經(jīng)（18%）、心經(jīng)（14%）、肺經(jīng)（10%）和腎經(jīng)（10%）為主。見圖3。

圖3 歸經(jīng)圖

2.1.4 醫(yī)案處方中藥物功效頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 參照《中藥學(xué)》[12]教材對藥物功效進(jìn)行歸納、統(tǒng)計(jì)和分析。結(jié)果顯示，功效頻次在前4 位的是活血化瘀類（22%）、祛風(fēng)濕類（16%）、解表類（15%）、補(bǔ)虛類（12%）。見圖4。

圖4 功效圖

2.2 醫(yī)案處方的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 將支持度分別設(shè)為10%、15%、20%，藥物關(guān)聯(lián)圖用“網(wǎng)絡(luò)展示”。見圖5。設(shè)置支持度為10，置信度為0.7，得到常用藥對及組合。見表4。對所得藥對進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。結(jié)果見表5。

圖5 中藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)展示圖

表4 支持度≥10 的中藥組合頻次情況

表5 支持度≥10 的藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.3 方劑的聚類分析 依據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析的結(jié)果得到的方劑聚類分析圖。見圖6。聚類得到的核心組方見表6。統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)的18個(gè)組合中含有12 味藥，總出現(xiàn)的頻次為219，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：其中含有當(dāng)歸或乳香的組合出現(xiàn)頻次較高。且這12 味藥中的當(dāng)歸、沒藥、乳香、紅花、獨(dú)活、白芷、川烏、川芎、防風(fēng)9 味藥在頻次統(tǒng)計(jì)中頻率都排在前11，故將其視為高頻藥物。此9 味藥合用有祛風(fēng)除濕、活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效。用kmeans 算法基于其藥物種類及出現(xiàn)頻次將其分為五類。Ⅰ類，當(dāng)歸-乳香-防風(fēng)-羌活-大青鹽-醋；Ⅱ類，防風(fēng)-當(dāng)歸-乳香-天麻-細(xì)辛-白芷；Ⅲ類，牛膝-獨(dú)活-羌活-木瓜-甘草-防風(fēng)；Ⅳ類，羌活-川烏-草烏-白鮮皮-紅花-木瓜；Ⅴ類，沒藥-乳香-當(dāng)歸-木瓜-紅花-防風(fēng)。見圖6A。再用kmeans 算法做出回歸模擬方程驗(yàn)證其分類的合理性。見圖6B?？梢宰鞒龌貧w方程證明了其分類合理性，五類藥物都在回歸線附近，進(jìn)一步證明了其分類的科學(xué)性。

圖6 聚類分析結(jié)果

表6 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則分析聚類得到的核心組方

2.4 新方劑組合 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則與聚類分析的結(jié)果，再綜合藥物的性味歸經(jīng)結(jié)果，將關(guān)聯(lián)分析出的高頻藥物，加上羌活可祛一身上下之風(fēng)濕，再加上細(xì)辛更可使藥力直達(dá)病所，促進(jìn)藥物吸收，因而將羌活、獨(dú)活、白芷、防風(fēng)、川烏、川芎、當(dāng)歸、乳香、沒藥、紅花、細(xì)辛這11 味藥組合為一個(gè)新的治療骨關(guān)節(jié)炎的外用方，命名為榮筋祛痹方。其藥物占比分析見圖7。再進(jìn)一步用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來驗(yàn)證榮筋祛痹方治療骨關(guān)節(jié)炎的理論依據(jù)。

圖7 榮筋祛痹方藥物頻率統(tǒng)計(jì)圖

2.4.1 榮筋祛痹方藥物活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測將上述綜合藥物性味、歸經(jīng)、功效及高頻藥物的分析結(jié)果，基于關(guān)聯(lián)分析與聚類結(jié)果組出的新方榮筋祛痹方（羌活、獨(dú)活、白芷、防風(fēng)、川烏、川芎、當(dāng)歸、乳香、沒藥、紅花、細(xì)辛）治療OA 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測。登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，獲取藥物的有效化學(xué)成分，再根據(jù)化合物藥代動力學(xué)特性，以類藥性（Drug-likeneee, DL）≥0.18，分子量（Molecular Weight,MW）≤500，脂水分配系數(shù)對數(shù)值（AlogP）在1～3 之間并結(jié)合文獻(xiàn)檢索結(jié)果確定藥物的活性化學(xué)成分。篩選獲得了榮筋祛痹方中71種有效成分，利用STITCH、CTD 和Symmap 數(shù)據(jù)庫搜索這些活性化合物在人體的潛在靶點(diǎn)，共對應(yīng)421個(gè)靶點(diǎn)。按degree 值大小將排名靠前的有效成分與靶點(diǎn)基因做出關(guān)系圖。見圖8。

圖8 榮筋祛痹方有效成分-靶點(diǎn)關(guān)系圖

2.4.2 OA 的靶點(diǎn)預(yù)測 登錄Genecards 數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點(diǎn)，以O(shè)steoarthritis 為檢索詞，提取數(shù)據(jù)庫中可信度較高（score≥5）的相關(guān)靶點(diǎn)2 072個(gè)。

2.4.3 榮筋祛痹方-OA 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將421個(gè)藥物候選靶點(diǎn)與2 072個(gè)OA 疾病靶點(diǎn)取交集，得到榮筋祛痹方治療OA 的靶點(diǎn)52個(gè)，用R語言做出韋恩圖。見圖9。將“榮筋祛痹方”與“骨關(guān)節(jié)炎”的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，去掉網(wǎng)絡(luò)中單一節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)不變，獲取蛋白之間相互作用信息，結(jié)果保存tsv 格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件繪制藥物治療OA 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見圖10。依據(jù)度值大小與其相關(guān)排前10 的靶點(diǎn)依 次 為 HIF1A、PTGS2、FOS、CCND1、CASP8、MMP2、IL4、SPP1、CDKN1A、MAPK14。

圖9 韋恩圖

圖10 榮筋祛痹方治療OA 的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4.4 靶點(diǎn)基因功能富集分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 分析結(jié)果生物過程（BP）主要富集在氧化反應(yīng)和老化反應(yīng)等方面。見圖11。GO 分析結(jié)果分子功能（MF）主要表現(xiàn)在細(xì)胞因子活性和受體-配體活性等方面。見圖12。GO 分析結(jié)果細(xì)胞組分（CC）主要涉及質(zhì)膜筏和細(xì)胞器外膜等方面。見圖13。

圖11 BP 分析

圖12 MF 分析

圖13 CC 分析

2.4.5 榮筋祛痹方作用的核心信號通路篩選 利用clusterProfiler 對上述方法篩選出的52個(gè)藥物作用潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號通路富集分析，并篩選p.adjust＜0.05 的信號通路，結(jié)果共富集到94 條信號通路。結(jié)果顯示，52個(gè)藥物作用靶點(diǎn)主要分布于腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）和細(xì)胞凋亡（Apoptosis）等多個(gè)信號通路中，這表明榮筋祛痹方可以通過多條通路調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎。見圖14。

圖14 KEGG 通路富集分析

3 討論

在中醫(yī)學(xué)中，與OA 相關(guān)的病名主要有“歷節(jié)病、白虎病、鶴膝風(fēng)”，該病屬于“痹證、膝痛、骨痹”范疇[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為OA 的發(fā)病原因大多是由于肝腎虧虛、氣血不足，以致風(fēng)寒濕侵襲、氣滯血瘀痰凝。據(jù)文獻(xiàn)資料統(tǒng)計(jì)，目前我國OA 的臨床治療手段排名如下：中藥方劑、外用中藥進(jìn)行關(guān)節(jié)沖洗、玻璃酸鈉療法、關(guān)節(jié)鏡、針灸推拿、針刀、關(guān)節(jié)置換術(shù)等[13]。由此可見中醫(yī)藥在國內(nèi)OA 的臨床治療中仍然占據(jù)主體地位[14～17]。目前OA 的中藥外用治療技術(shù)手段主要有敷貼、熏洗、熏蒸、熱熨和離子導(dǎo)入等，手段多樣，療效顯著，副作用較小[18～19]。根據(jù)管詠梅等[20]對2004～2015年OA 外用中藥治療的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行的頻率、關(guān)聯(lián)規(guī)則及聚類分析所得出的結(jié)論，高頻藥味及外用藥方的處方治則應(yīng)為活血化瘀、祛風(fēng)除濕。

本研究擬利用中醫(yī)輔助平臺軟件提供的改進(jìn)互信息法、Kmens 算法 + 聚類、Kmens 算法 + 回歸模擬三個(gè)數(shù)據(jù)挖掘方法，實(shí)現(xiàn)藥物間關(guān)聯(lián)性分析，從而聚類出核心組合，對清宮系列書籍用藥組方的隱形經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步挖掘分析，旨在為OA 的中藥外用治療提供參考與依據(jù)。藥味頻次統(tǒng)計(jì)顯示，祛風(fēng)濕類藥（綜合解表藥中的祛風(fēng)除濕類藥物）最多，用量最大，其次為補(bǔ)益藥、活血化瘀類藥物。故中藥外用在OA 的臨床治療原則應(yīng)為“祛風(fēng)除濕、活血化瘀”，兼以補(bǔ)益肝腎。該原則是根據(jù)OA 的證候特點(diǎn)（痰濕、瘀血）及病機(jī)特征（肝腎虧虛、氣血不足）確立的。從組方中藥的性味歸經(jīng)而言，以性溫平、味辛苦、歸肝脾經(jīng)的藥物使用頻次最多。以上高頻用藥來自諸多經(jīng)典醫(yī)著，結(jié)合經(jīng)典與臨床，可見中藥外用治療OA旨在對癥治療，緩急止痛。

聚類分析所得五類核心組合，大都以祛風(fēng)濕、活血化瘀類藥物為主。Ⅰ類當(dāng)歸、乳香、防風(fēng)、羌活、大青鹽、醋；Ⅱ類防風(fēng)、當(dāng)歸、乳香、天麻、細(xì)辛、白芷；Ⅲ類牛膝、獨(dú)活、羌活、木瓜、甘草、防風(fēng)；Ⅳ類羌活、川烏、草烏、白鮮皮、紅花、木瓜；Ⅴ類沒藥、乳香、當(dāng)歸、木瓜、紅花、防風(fēng)。以第Ⅴ類藥為例，其中防風(fēng)祛風(fēng)止痛，而木瓜舒筋活絡(luò)、勝濕除痹止痛，兩者合用共奏祛風(fēng)勝濕止痛之功。乳香、沒藥、紅花發(fā)揮活血止痛的作用，再配伍當(dāng)歸既能補(bǔ)血又能活血，五藥合用共奏祛風(fēng)除濕、活血化瘀、補(bǔ)肝腎的功效。結(jié)合中藥的性味歸經(jīng)發(fā)現(xiàn)其用藥符合OA 內(nèi)因肝腎虧虛、外感風(fēng)寒濕邪、中間病理產(chǎn)物-血瘀的中醫(yī)發(fā)病特點(diǎn)。因此基于清宮系列書籍的外用方中用藥的數(shù)據(jù)分析聚類所得的核心組合是符合中醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)炎的處方特點(diǎn)的，基于理論的分析能達(dá)到治療OA 的作用，所以對今后臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。

在核心組合符合用藥規(guī)律的基礎(chǔ)上，總結(jié)數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果，組合出新方，再采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在微觀水平來驗(yàn)證新方對骨關(guān)節(jié)炎的治療效果，并在此基礎(chǔ)上指導(dǎo)臨床用藥。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果可以看出，無論是從蛋白水平還是從細(xì)胞分子水平及信號通路的角度都證明了新方在理論上是對骨關(guān)節(jié)炎有治療效果的。為進(jìn)一步肯定新方的具體療效，還需進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭游飳?shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證。本研究是基于陳可冀主編之清宮系列書籍治療OA 的用藥組方規(guī)律研究，科學(xué)整理了本書治療OA 常見用藥規(guī)律與組方邏輯，利用現(xiàn)代數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，分析用藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則及聚類，分析得出核心組方，再總結(jié)數(shù)據(jù)分析結(jié)果組合出榮筋祛痹方，并用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)加以驗(yàn)證榮筋祛痹方治療骨關(guān)節(jié)炎的可行性。利用數(shù)據(jù)挖掘來研究清宮系列書籍并非意味著對經(jīng)典閱讀的舍棄，而是利用現(xiàn)代技術(shù)對國醫(yī)經(jīng)典進(jìn)行科學(xué)的歸納總結(jié)。本研究在一定程度上改進(jìn)了傳統(tǒng)醫(yī)案學(xué)習(xí)的不足，但是對結(jié)果的正確判讀仍然需要醫(yī)者具備扎實(shí)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)，并結(jié)合豐富的臨床診療經(jīng)驗(yàn)。