馮 亮，余 科，楊 艷，劉雙雙，余愛農(nóng)

（湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室 湖北 恩施 445000）

風(fēng)味是食品品質(zhì)的基本屬性之一，也是影響消費者喜好的關(guān)鍵因素[1-3]。食品的特征風(fēng)味形成途徑較多，有些在加工過程中形成，其中較為重要的一類反應(yīng)是美拉德反應(yīng)[4-6]。美拉德反應(yīng)的本質(zhì)是氨基酸與羰基化合物之間的反應(yīng)。由于L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，ASA）具有潛在的羰基結(jié)構(gòu)且廣泛存在于食物中，因此對于其美拉德反應(yīng)的研究成為熱點[7-14]。目前，多數(shù)研究僅限于2 組分美拉德反應(yīng)，即L-抗壞血酸與1 種氨基酸的反應(yīng)，這種模擬反應(yīng)比較簡單[15-17]。而食品工業(yè)中涉及的美拉德反應(yīng)較為復(fù)雜，各反應(yīng)物之間相互作用，使得實際結(jié)果與模擬結(jié)果存在很大差異。研究L-抗壞血酸與2 種及以上的氨基酸并存的美拉德反應(yīng)模擬體系，具有非常重要的現(xiàn)實意義。

食品中的美拉德反應(yīng)受多方面因素影響，其中最直接的影響因素是氨基酸種類[18-19]，是否有含硫氨基酸參與反應(yīng)，對體系揮發(fā)性化合物的形成影響很大[20-21]。其次是反應(yīng)環(huán)境，其中pH 值對美拉德反應(yīng)中揮發(fā)性物質(zhì)形成與分布的影響至關(guān)重要[22-23]。本研究主要關(guān)注美拉德復(fù)雜體系的反應(yīng)因素，特別是反應(yīng)體系在不同pH 值條件下對揮發(fā)性化合物的生成與釋放的影響。選取普通氨基酸代表——甘氨酸 （Glycine，Gly） 和含硫氨基酸代表——L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys），兩者都是食品工業(yè)中非常重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，如用作食品調(diào)味劑、面粉改良劑等[24-25]。以這2 種氨基酸為反應(yīng)模型，考察它們與L-抗壞血酸之間的美拉德反應(yīng)，模擬食品工業(yè)中美拉德反應(yīng)的復(fù)雜反應(yīng)體系。在對它們自降解及2 組分體系相互反應(yīng)的基礎(chǔ)上，探討pH 值對L-抗壞血酸-L-半胱氨酸-甘氨酸3組分體系揮發(fā)性物質(zhì)形成與分布的影響，并探討各揮發(fā)物質(zhì)可能的生成機制。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純級，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；C5-C20正構(gòu)烷烴、3-氯-2，5-二甲基吡嗪，美國Sigma-Aldrich 公司；試驗用水均為自制二次蒸餾水。

DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器，河南予華儀器有限公司；P160001 厚壁耐壓瓶，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；20 mL 頂空瓶、CONCEPT 多功能樣品前處理系統(tǒng)，德國PAS 公司；SZ-93 自動雙重蒸餾水器，上海亞榮生化儀器廠；BS-124S 電子天平、PB-21 pH 計，德國賽多利斯公司；GC6890N-MS5975I 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5（30 m） 毛細(xì)管色譜柱，美國安捷倫公司；65 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷DVB/CAR/PDMS 固相萃取頭，美國Supelco 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 反應(yīng)液的配制 根據(jù)課題組之前的報道[8-10]，發(fā)現(xiàn)提高反應(yīng)溫度和延長反應(yīng)時間有利于揮發(fā)性化合物的生成，因此本研究選擇固定的反應(yīng)時間120 min 和溫度150 ℃，用磷酸鹽緩沖溶液配制不同pH 值 （4.5，5.8，7.0，8.0，9.5） 的反應(yīng)溶液，各體系原料濃度為0.05 mol/L。試驗分組如表1所示。每組試驗平行反應(yīng)3 次，結(jié)果取平均值。

表1 試驗列表Table 1 Experiment list

1.2.2 檢測分析方法 采用多功能前處理系統(tǒng)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GCMS）聯(lián)用分析技術(shù)，對反應(yīng)液的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性、定量檢測，檢測方法與條件參數(shù)參考課題組之前的報道[8-10]。

采用內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)定量。通過內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（3-氯-2，5-二甲基吡嗪）的標(biāo)準(zhǔn)曲線[A=37885.51C+8863280，式中，C——質(zhì)量濃度（mg/L），R2=0.9996]，結(jié)合檢測樣品的峰面積，計算各揮發(fā)性化合物的濃度。

在相同萃取及GC-MS 參數(shù)條件下，對C5-C20正構(gòu)烷烴進(jìn)行檢測，依此計算各物質(zhì)的保留指數(shù)（Linear Retention index，RI）。各樣品GC-MS 分析結(jié)果與NIST 20 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比篩選，然后對比樣品保留指數(shù)以及文獻(xiàn)報道保留指數(shù)，部分化合物用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對比，最終確定化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 自降解反應(yīng)

由于各原料自降解過程所產(chǎn)生的物質(zhì)是其發(fā)生美拉德反應(yīng)的基礎(chǔ)，因此對各物質(zhì)的自降解研究就顯得尤為重要。同時單獨分析各原料物質(zhì)的自降解揮發(fā)性產(chǎn)物，有利于探究復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性物質(zhì)的生成機制[26]。經(jīng)試驗初探分析，發(fā)現(xiàn)甘氨酸比較穩(wěn)定，受熱無揮發(fā)性物質(zhì)生成[27]。在此主要探討L-抗壞血酸和L-半胱氨酸自降解過程揮發(fā)性物質(zhì)的生成情況，如表2所示。

表2 L-抗壞血酸、L-半胱氨酸自降解揮發(fā)性物質(zhì)的生成Table 2 The volatile formation form the self-degradation reaction of ASA and Cys

（續(xù)表2）

由于L-抗壞血酸具有五元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，很容易發(fā)生水解開環(huán)，繼而發(fā)生裂解反應(yīng)。由表2可知，L-抗壞血酸在不同pH 值條件下生成了不同種類和含量的揮發(fā)性物質(zhì)。在酸性條件下，L-抗壞血酸主要生成糠醛以及呋喃類化合物；當(dāng)溶液pH值逐漸升高，趨于中、堿性時，L-抗壞血酸自降解主要生成環(huán)戊烯酮類化合物以及2，5-二甲酰呋喃。

L-半胱氨酸是含硫氨基酸的代表，因硫的原子半徑比較大，其最外層電子受原子核影響較小，反應(yīng)活性高。從表2可知，L-半胱氨酸自降解產(chǎn)物主要以噻吩類化合物為主，且大多數(shù)化合物在酸、堿條件下均可生成。一些簡單結(jié)構(gòu)化合物如3-乙基噻吩和噻吩-2-硫醇，更容易在酸性環(huán)境下生成。

2.2 2 組分美拉德反應(yīng)

基于L-抗壞血酸與氨基酸的美拉德反應(yīng)報道較多，由于甘氨酸與L-半胱氨酸的2 組分反應(yīng)中甘氨酸并不活躍，L-半胱氨酸為主要反應(yīng)原料，因此本試驗主要討論L-抗壞血酸與甘氨酸、L-抗壞血酸與L-半胱氨酸2 組分美拉德反應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)生成情況，如表3～4 所示。

2.2.1 L-抗壞血酸/甘氨酸美拉德反應(yīng) L-抗壞血酸與甘氨酸的美拉德反應(yīng)生成的揮發(fā)性物質(zhì)如表3所示。

表3 L-抗壞血酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)的生成Table 3 The volatile formation in Maillard reaction of ASA/Gly

（續(xù)表3）

從表3可知，L-抗壞血酸與甘氨酸經(jīng)美拉德反應(yīng)生成的揮發(fā)性物質(zhì)除少數(shù)吡啶、吡咯和呋喃類化合物外，其它主要為吡嗪類衍生物，而且pH值對此體系揮發(fā)生物質(zhì)的生成與分布影響較大。與表2對比發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，揮發(fā)性物質(zhì)主要來自L-抗壞血酸的自降解產(chǎn)物，而在堿性條件下主要為吡嗪類化合物。這說明在酸性條件下，甘氨酸不能提供美拉德反應(yīng)所需氨基前體物，而堿性條件下可以。

2.2.2 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng) 與L-半胱氨酸有關(guān)的美拉德反應(yīng)模型常用來模擬研究肉香味化合物的形成，肉香味的來源主要是其反應(yīng)生成了一些含硫揮發(fā)性化合物。不同pH 值條件下L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng)生成的揮發(fā)性物質(zhì)如表4所示。

表4 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)生物質(zhì)的生成Table 4 The volatile formation in Maillard reaction of ASA/Cys

（續(xù)表4）

由表4可知，L-抗壞血酸與L-半胱氨酸反應(yīng)生成的揮發(fā)性化合物主要是含硫的噻吩、噻唑、硫醇類化合物，以及含氮的吡嗪化合物。噻吩類化合物作為主要生成物，在酸、中、堿性條件下均有生成，這可能與硫元素有較好的化學(xué)活性有關(guān)。吡嗪類化合物是美拉德反應(yīng)的標(biāo)志性化合物，主要在堿性條件下生成，這可能是由于吡嗪的生成需要氨基前體化合物，而氨基前體化合物在堿性條件下更容易生成。

綜合分析表3和表4可知，氨基前體物在堿性條件下更容易生成，吡嗪類化合物的生成依賴于氨基前體物的生成。

2.3 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸和甘氨酸是3 種各具代表性的化合物，用來模擬美拉德復(fù)雜反應(yīng)體系有非常重要的現(xiàn)實意義。3 組分體系生成的揮發(fā)性化合物如表5所示。

表5 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)生物質(zhì)的生成Table 5 The volatile formation in Maillard reaction of ASA/Cys/Gly

（續(xù)表5）

分析表5發(fā)現(xiàn)，3 組分復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系的揮發(fā)性物質(zhì)主要是噻吩、噻唑和吡嗪類化合物，且體系的pH 值對各化合物的分布及生成有較大影響。噻吩類化合物在不同pH 值體系中均能生成；在酸性條件下，主要生成結(jié)構(gòu)簡單的噻吩類化合物和硫醇類化合物，幾乎沒有吡嗪類化合物生成。這與L-抗壞血酸/L-半胱氨酸2 組分反應(yīng)體系比較相似，其原因可能是由于甘氨酸在酸性條件下比較穩(wěn)定，沒有參與到反應(yīng)中去；在中堿性條件下，主要生成物是噻吩和噻唑類化合物，而吡嗪類化合物僅有少量生成。相比于L-抗壞血酸/甘氨酸體系有大量吡嗪類化合物生成，說明噻吩和噻唑類化合物的生成與吡嗪類化合物的生成具有明顯的競爭關(guān)系，且噻吩和噻唑的生成占有較大優(yōu)勢。

由于L-抗壞血酸/L-半胱氨酸2 組分體系和L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸3 組分體系在揮發(fā)性物質(zhì)的生成種類分布上有相似之處，其揮發(fā)性物質(zhì)的生成機制可能也類似，因此對比分析了兩體系的揮發(fā)性物質(zhì)生成情況雷達(dá)圖，如圖1所示。

圖1 不同pH 值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of Maillard reaction products under different pH values

整體來看，2 個體系生成物的種類分布非常相似，生成物均以噻吩、噻唑、硫醇和吡嗪類化合物為主，其中，噻吩和硫醇類化合物的含量較高。在3 組分體系中由于甘氨酸的參與，氮源更加豐富，吡嗪類物質(zhì)濃度可能會提高，然而對比表3～5數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，3 組分體系吡嗪類化合物的濃度并沒有明顯增加，而含硫化合物的含量有大幅增加。此結(jié)果表明含硫化合物的生成相比于吡嗪類化合物的生成在各反應(yīng)體系中具有更大優(yōu)勢。

2.4 反應(yīng)機理分析

根據(jù)不同條件下的試驗結(jié)果，提出了L-抗壞血酸、L-半胱氨酸體系揮發(fā)性化合物可能的生成機制，如圖2所示。

圖2 L-抗壞血酸、L-半胱氨酸自降解揮發(fā)性物質(zhì)的生成及其產(chǎn)物相互作用機制Fig.2 The volatile formation form the self-degradation of ASA and Cys and the reaction mechanism between different products

L-抗壞血酸是一個五元內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，很容易水解開環(huán)、脫羧，生成阿拉伯糖或木糖等五碳糖結(jié)構(gòu)。五碳糖進(jìn)一步裂解，生成羥基乙醛、乙二醛、1，3-丁二酮、甲醛和乙醛等帶有活潑羰基的結(jié)構(gòu)，這些小分子作為活性中間體會進(jìn)一步相互反應(yīng)，最終生成各種揮發(fā)性化合物。L-半胱氨酸是兩性化合物，大部分以離子形態(tài)存在。加熱時，L-半胱氨酸發(fā)生Strecker 降解，生成氨氣、硫化氫以及巰基乙醛，進(jìn)一步降解生成甲醛、乙醛等小分子活性物質(zhì)。L-半胱氨酸也可以通過脫羧生成2-氨基乙硫醇，再脫去硫化氫、氨氣生成乙炔。乙炔在硫化氫作用下發(fā)生加成反應(yīng)生成噻吩，噻吩再與各種小分子反應(yīng)生成各種噻吩衍生物。

吡嗪、噻吩和噻唑類化合物的生成如圖2c 所示。含有羰基的活性中間體組成目標(biāo)分子的碳骨架，再由含有雜原子的硫化氫、氨氣取代，最后經(jīng)過脫水、環(huán)化、還原等步驟生成目標(biāo)分子。

各揮發(fā)性化合物在酸、中、堿性條件下的生成機理如圖3所示。在酸性條件下生成的揮發(fā)性化合物種類相對較少，主要為噻吩和硫醇類化合物。噻吩類化合物由噻吩母體結(jié)構(gòu)與甲醛、乙醛發(fā)生取代反應(yīng)，生成噻吩衍生物；而硫醇類化合物則是硫化氫取代氧原子生成的。在中、堿性條件下，吡嗪、噻吩和噻唑均有生成，由于各自側(cè)基結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致最終的揮發(fā)性物質(zhì)種類繁多。這些化合物側(cè)基多為甲基、乙基和乙?；贁?shù)側(cè)基為大于2個碳數(shù)的飽和/不飽和烴基。此反應(yīng)過程涉及較多的親核加成、取代、脫水及消去反應(yīng)等。其中，多為2-羥基乙醛、乙二醛及其衍生物與氨氣、硫化氫間的親核加成或親核取代反應(yīng)，生成含氮、硫的中間產(chǎn)物，然后經(jīng)過脫水環(huán)化、還原反應(yīng)生成吡嗪、噻吩、噻唑、硫醇類化合物。

圖3 酸、中、堿性條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)生成機制Fig.3 The formation mechanism of different volatile under acid，medium and alkaline conditions

3 結(jié)論

3 組分復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系與單組分及2 組分反應(yīng)體系在揮發(fā)性物質(zhì)種類與分布上有較大區(qū)別；反應(yīng)體系中吡嗪類化合物和含硫類化合物存在競爭關(guān)系。從生成物的種類、分布與含量等分析發(fā)現(xiàn)，L-抗壞血酸自降解主要生成呋喃類化合物；L-半胱氨酸自降解主要生成噻吩類化合物；L-抗壞血酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)主要生成豐富的吡嗪類化合物；L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng)主要生成噻吩、噻唑、吡嗪、硫醇類化合物，吡嗪類化合物種類和濃度較少；L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸3 組分美拉德反應(yīng)生成物的分布與L-抗壞血酸/L-半胱氨酸2 組分體系比較相似，而3 組分體系生成的物質(zhì)含量更多。從反應(yīng)機制上看，不含硫氨基酸的美拉德反應(yīng)生成物主要為吡嗪類物質(zhì)；而含硫氨基酸的美拉德反應(yīng)生成物主要為含硫的噻吩、噻唑以及硫醇類化合物；當(dāng)這2 種氨基酸同時存在發(fā)生美拉德反應(yīng)時，二者存在競爭反應(yīng)，然而由于硫原子反應(yīng)活性較高，生成物仍以含硫化合物為主，伴有少量吡嗪類化合物存在。