李美東，黃秀芳，羅 凱

（湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 湖北 恩施 445000）

多糖 （Polysaccharide） 是由大量通過糖苷鍵（α-或β-） 脫水聚合相互連接而成的單糖殘基組成的一種生物大分子物質(zhì)[1]。自然界中，幾乎所有活的生物體中都含有多糖。人們習(xí)慣上把從生物體中提取的并通過研究證明具有一定生理活性的多糖稱為生物活性多糖 （Bioactive polysaccharides）。近年來，由于人們?nèi)粘Ｉ钏降奶岣吆蛯ι眢w健康知識(shí)的逐步了解，生物活性多糖因本身的低毒性、廣泛性和高效性等特點(diǎn)而被作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑被大量的研究。多糖的生物活性主要包括增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)[2-3]、抗氧化[4-5]、抗病毒[6-7]、抗腫瘤[8-9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗凝血[12]等。

壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis），十字花科碎米薺屬，別名雀兒菜、白帶草，1年到2年生草本植物，常見于海拔1 km 以下的低地草叢中，在全中國分布廣泛[13]。壺瓶碎米薺具有較強(qiáng)富硒能力?，F(xiàn)有研究中，對碎米薺屬的基因組學(xué)研究主要有：①基因組學(xué)研究，如：Bleeker 等[14]對德國的碎米薺種屬的DNA 序列進(jìn)行研究，得出結(jié)論：此種碎米薺是來自于亞洲的物種；②蛋白質(zhì)組學(xué)研究，如：Both 等[15]通過檢測壺瓶碎米薺中的無機(jī)硒、有機(jī)硒，得出壺瓶碎米薺生物體內(nèi)無機(jī)硒占20%，有機(jī)硒以硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸的形式存在；③硒耐受能力測試[16-17]，Zhou 等[2]從壺瓶碎米薺中組裝48 989 個(gè)單基因，分別在根和葉中表達(dá)39 579 個(gè)和33 510 個(gè)。通過差異表達(dá)分析鑒定出位于4 個(gè)不同路徑中的25 個(gè)基因，這些路徑對壺瓶碎米薺中的亞硒酸鹽有顯著響應(yīng)；④品種改良[18]等方面研究。

本試驗(yàn)中采用超聲波與酶輔助提取壺瓶碎米薺多糖，采用Sevag 法除蛋白，通過DEAE-52 纖維素分級(jí)醇沉，采用Sephadex G-100 和紫外光譜法進(jìn)行純度鑒定，并研究其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壺瓶碎米薺，采自湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)漁塘壩。自然風(fēng)干后粉碎過100 目篩，貯存于試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

纖維素酶、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、DEAE-52 纖維素、Sephadex G-100 葡聚糖、乙醇、苯酚、硫酸、三氯甲烷、正丁醇均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS5 紅外分析儀，賽默飛世爾公司；KQ5200 型超聲波儀，北京中儀匯豐科技有限公司；BS-100A 自動(dòng)部分收集器、HL-2 恒流泵，北京佳航博創(chuàng)科技有限公司；BC-W203 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海耀特儀器設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥箱，上海啟前電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取 稱取1.0 g 壺瓶碎米薺粉末，適當(dāng)條件下經(jīng)超聲波、酶處理后進(jìn)行熱水提取，收集濾液后，4 000 r/min 離心15 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入95%乙醇4 ℃醇沉至少10 h，4 000 r/min 離心10 min，冷凍干燥得到壺瓶碎米薺粗多糖。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 液料比：15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1；纖維素酶添加量：0%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%；超聲波時(shí)間：10，15，20，25，30 min；提取時(shí)間：30，60，90，120，150 min；提取溫 度：60，70，80，90，100 ℃。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、纖維素酶添加量、超聲波時(shí)間、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，以碎米薺多糖得率為考察目標(biāo)，利用Design-Expert.V8.0.6 軟件進(jìn)行5 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Level table of experimental factors for response surface

1.3.4 多糖含量的測定 多糖含量測定均使用苯酚-硫酸法[19]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0089x-0.0003，R2=0.9961。

1.3.5 除蛋白

1.3.5.1 蛋白質(zhì)含量測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.006x+0.0085，R2=0.9979。

1.3.5.2 方法 Sevag 法：將正丁醇與三氯甲烷按照1∶4 的體積比配制Sevag 試劑，將壺瓶碎米薺粗多糖溶液與sevag 試劑以4∶1 的體積比混合后，封口，置于搖床上劇烈振蕩30 min 后，轉(zhuǎn)置于分液漏斗中靜置30 min。收集上層液，待用。

1.3.6 分級(jí) 將DEAE-52 纖維素層析柱用去離子水平衡，將樣品溶液上樣至層析柱中，以0，0.1，0.2，0.4，0.7 mol/L 的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min，每管收集10 mL，多糖濃度由苯酚-硫酸法在波長490 nm 處測定，以管數(shù)為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制曲線。

1.3.7 純度鑒定 將Sephadex G-100 層析柱用去離子水平衡，將樣品溶液上樣至層析柱中，用蒸餾水洗脫，流速為0.1 mL/min，每管收集2 mL，多糖濃度由苯酚-硫酸法在波長490 nm 處測定，以管數(shù)為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制曲線。

1.3.8 體外抗氧化能力測定

1.3.8.1 ABTS 自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[20]的方法，并對試驗(yàn)步驟稍作修改。配制0.007 mol/L 的ABTS 溶液和0.14 mol/L 的過硫酸鉀溶液，按1∶1（體積比）混合后在25 ℃下避光反應(yīng)12 h，為ABTS 自由基儲(chǔ)備液。使用PBS（pH 7.4）將儲(chǔ)備液在波長734 nm 處的吸光值調(diào)整為0.70±0.02，備用。取不同濃度的壺瓶碎米薺粗多糖溶液1 mL（空白組取等量的純水），加3 mL 調(diào)整吸光值后的儲(chǔ)備液，于暗處反應(yīng)1 h，在波長734 nm 處測定其吸光度，VC 作為陽性對照，每組重復(fù)3 次。

1.3.8.2 羥基自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[21]的方法，并對試驗(yàn)步驟稍作修改。量取不同濃度的壺瓶碎米薺粗多糖溶液1 mL 于具塞試管中（空白組取等量的純水），加入2 mL 3 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和1.5 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，再加入0.1 mL 0.03%H2O2溶液啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃下水浴30 min 后，在波長510 nm 處測定吸光值，VC作為陽性對照，每組重復(fù)3 次。

1.3.8.3 總還原能力測定 參考文獻(xiàn)[22]的方法，并對試驗(yàn)步驟稍作修改。量取不同濃度的壺瓶碎米薺粗多糖溶液1 mL 于具塞試管中（空白組取等量的純水），加入1.0 mL 1.0 mol/L pH 6.6 PBS 和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]溶液，50 ℃下水浴20 min，冷卻后向其中加入2.0 mL 10%TCA 溶液，5 000 r/min 離心5 min 后，取2.5 mL 上層清液，再加入2.5 mL 超純水和0.5 mL 1%FeCl3溶液，混勻后在波長700 nm 處測定吸光值，VC 作為陽性對照，每組重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為平均值。響應(yīng)面試驗(yàn)利用Design-Expert.V8.0.6 軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)利用SPSS 24 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對壺瓶碎米薺多糖得率的影響 在植物多糖提取過程中，原料與溶劑的比例是十分關(guān)鍵的參數(shù)，本試驗(yàn)探究了不同液料比對碎米薺多糖得率的影響，所得結(jié)果如圖1a 所示。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑用量達(dá)到300 mL，原料為10 g 時(shí)，碎米薺多糖的得率達(dá)到最大值，若繼續(xù)增加溶劑用量，壺瓶碎米薺多糖的得率反而呈緩慢下降的趨勢。分析其原因可能是當(dāng)液料比達(dá)到30∶1 時(shí)，糖類物質(zhì)已基本溶出，再增加溶劑的用量，使多糖的損失率提高，因此，確定液料比為30∶1 比較合適。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor experiment results

2.1.2 纖維素酶添加量對壺瓶碎米薺多糖得率的影響 植物體內(nèi)含有大量的纖維素，利用適量的纖維素酶對植物原料進(jìn)行處理，能提高多糖的得率。本試驗(yàn)探究了纖維素酶添加量對碎米薺多糖得率的影響規(guī)律，結(jié)果如圖1b 所示。結(jié)果表明，添加纖維素酶能明顯提高多糖得率，而且隨著添加量的增加，多糖得率也在增加，在2.5%時(shí)最大。

2.1.3 提取時(shí)間對壺瓶碎米薺多糖得率影響 提取時(shí)間作為提取多糖的另一個(gè)重要的影響因素，本試驗(yàn)對不同提取時(shí)間下壺瓶碎米薺多糖的得率進(jìn)行探究，結(jié)果如圖1c 所示。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的延長，多糖得率在逐漸上升，然而多糖的絕對增長量不高，在考慮到節(jié)約時(shí)間成本的情況下，選擇120 min 比較合適。

2.1.4 提取溫度對壺瓶碎米薺多糖得率影響 提取溫度是對多糖得率的一個(gè)重要的影響因素，本試驗(yàn)探究不同提取溫度對壺瓶碎米薺多糖得率的影響，結(jié)果如圖1d 所示。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，多糖得率在逐漸上升，在80～90 ℃之間，多糖量有一個(gè)大的提升，故選擇90 ℃比較合適。

2.1.5 超聲波時(shí)間對壺瓶碎米薺多糖得率的影響 超聲波通過對細(xì)胞膜通透性的改變和破壞，能刺激細(xì)胞將細(xì)胞液內(nèi)物質(zhì)釋放，因此能夠有利于植物細(xì)胞中生物活性物質(zhì)的提取，本試驗(yàn)探究了不同超聲時(shí)間對碎米薺多糖得率的影響規(guī)律，結(jié)果如圖1e 所示。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的逐漸延長，碎米薺多糖的得率呈先上升后下降的趨勢，在超聲時(shí)間到20 min 時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)繼續(xù)增加超聲時(shí)間，碎米薺多糖得率呈下降趨勢。分析其原因可能是超聲時(shí)間過長，溶液溫度也變高，導(dǎo)致多糖類物質(zhì)穩(wěn)定性下降，部分被氧化，得率降低。因此，超聲時(shí)間選擇20 min 為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面分析 根據(jù)Design-Expert 軟件中的Box-Behnken 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，料液比、纖維素酶添加量、超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間為響應(yīng)面因變量，碎米薺粗多糖為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。所得試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回歸模型的方差分析 如表2所示，BBD設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行了46 次，以優(yōu)化5 個(gè)單獨(dú)的提取參數(shù)。結(jié)果表明，在以下試驗(yàn)條件下能取得最大收益：料液比1∶30，超聲時(shí)間24.80 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間120 min，多糖提取量為44.54 mg/g。通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，響應(yīng)值與變量之間以下列二階多項(xiàng)式方程式關(guān)聯(lián)：

Y=5.44+0.25A-0.12B-0.21C-0.024D-0.31E-0.048AB+0.047AC-0.012AD+0.20AE+0.11BC-0.076BD-0.0021BE-0.16CD-0.37CE+0.30DE-0.49A2-0.34B2-0.42C2-0.37D2-0.23E2

式中，Y——多糖的質(zhì)量（mg）；A，B，C，D，E——液料比、超聲波時(shí)間、纖維素酶酶量、提取溫度、提取時(shí)間。

把響應(yīng)面分析所得數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)方程的有效性，回歸模型的方差分析如表3所示。通常模型中有較高的F 值和較低的P 值會(huì)使模型更加的顯著，在本試驗(yàn)中二次回歸模型的F=5.013，P＜0.01，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)是所得數(shù)學(xué)模型中的數(shù)據(jù)變異，本試驗(yàn)中失擬項(xiàng)F=0.4739，P＞0.05，表示模型無失擬項(xiàng)的存在，已然能充分說明實(shí)際情況，回歸模型是合適的。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為了更直觀的預(yù)測自變量與響應(yīng)值的關(guān)系，使用Design-Expert 繪制出如圖2所示的3D 響應(yīng)圖和輪廓圖，這些圖能明顯的看出各個(gè)變量之間兩兩存在的聯(lián)系。由圖可知，兩兩因素交互在可選范圍內(nèi)均有最大值。從圖2中AB 交互項(xiàng)3D 輪廓圖中分析可知，在其它因素都恒定時(shí)，隨著超聲波時(shí)間的延長，提取壺瓶碎米薺多糖量先增加后下降，液料比同之，說明在這兩個(gè)因素的交互作用下，多糖提取有最大值，同時(shí)等高線圖形為橢圓形，曲面陡峭，說明這兩個(gè)因素交互時(shí)有顯著影響。同理可分析其它因素之間的顯著性。

圖2 各因素交互作用響應(yīng)面與等高線圖Fig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors

使用此模型方程對各因素選擇最佳條件：液料比30∶1，超聲時(shí)間24.80 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間120 min，多糖提取量為44.54 mg/g。為了驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果不偏離試驗(yàn)值且能正常實(shí)施，將最佳條件修改為：液料比30∶1，超聲時(shí)間25 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間120 min，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。測得實(shí)際值為48.53 mg/g，與預(yù)期并無顯著性差異，說明此設(shè)計(jì)可用于超聲波酶法提取壺瓶碎米薺粗多糖的預(yù)測和分析。

2.3 除蛋白結(jié)果

通過重復(fù)使用Svage 法對壺瓶碎米薺多糖溶液進(jìn)行除蛋白，在每次步驟完成后對溶液的蛋白質(zhì)含量以及多糖含量進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得到如圖3所示的蛋白去除率和多糖保留率圖。從圖中可知，隨著使用Svage 法次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)含量明顯降低，然而多糖的損耗也隨之增多，到第8 次時(shí)蛋白質(zhì)的去除率趨于平緩，而多糖的損耗量卻沒變化，故選擇使用Svage 法除蛋白7次。

圖3 蛋白去除率和多糖保留率Fig.3 Protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.4 碎米薺多糖純化工藝

由圖4可知，在第30～37 管處出現(xiàn)了第1 個(gè)峰，第48～58 管處出現(xiàn)了第2 個(gè)峰，第70～79 管處出現(xiàn)了第3 個(gè)峰，第96～102 管處出現(xiàn)了第4 個(gè)峰，且這4 處峰都比較對稱，證明利用NaCl 溶液濃度梯度洗脫能將壺瓶碎米薺多糖較好的分離，將4 種組分分別命名為CHP-1、CHP-2、CHP-3、CHP-4。

圖4 DEAE-52 纖維素層析柱試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Experimental results of DEAE-52 cellulose column

2.5 純度鑒定結(jié)果

由圖5可得，4 種組分經(jīng)Sephadex G-100 層析柱洗脫后呈現(xiàn)單一且對稱的峰，說明純化過后的各組分壺瓶碎米薺多糖相對分子質(zhì)量較均勻且純度較高。

圖5 Sephadex G-100 層析柱洗脫曲線Fig.5 Experimental results of Sephadex G-100 column

2.6 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 ABTS 自由基清除能力測定 ABTS 自由基清除能力通常作為抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力測定的指標(biāo)。不同質(zhì)量濃度的壺瓶碎米薺粗多糖對ABTS 自由基清除率如圖6a 所示。結(jié)果顯示，壺瓶碎米薺粗多糖的質(zhì)量濃度與ABTS 自由基清除率呈正相關(guān)，隨著壺瓶碎米薺粗多糖質(zhì)量濃度的升高，對ABTS 自由基的清除率也隨之升高；在相同質(zhì)量濃度下，壺瓶碎米薺粗多糖的清除能力遠(yuǎn)小于VC。

2.6.2 羥基自由基清除能力測定 羥基自由基在所有自由基中具有最強(qiáng)的氧化能力，人體內(nèi)產(chǎn)生大量的羥基自由基，會(huì)對機(jī)體中的生物大分子（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸）造成嚴(yán)重的破壞，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生癌變[23]。不同質(zhì)量濃度的壺瓶碎米薺粗多糖對氧基自由基的清除率如圖6b 所示。結(jié)果顯示，壺瓶碎米薺粗多糖的質(zhì)量濃度與羥基自由基的清除率呈正相關(guān)，并且隨著濃度的升高，清除能力也越來越強(qiáng)；而對羥基自由基的清除能力還是遠(yuǎn)小于同質(zhì)量濃度的VC。

2.6.3 總還原能力測定 通過不同質(zhì)量濃度的壺瓶碎米薺粗多糖對總還原力的測定，結(jié)果如圖6c所示。結(jié)果顯示，壺瓶碎米薺粗多糖的質(zhì)量濃度與總還原力呈正相關(guān)，并且隨著質(zhì)量濃度的升高，還原能力也越強(qiáng)；而還原能力還是遠(yuǎn)小于同質(zhì)量濃度的VC。

圖6 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Antioxidant capacity test results

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得到壺瓶碎米薺最佳的提取工藝：液料比30∶1，超聲時(shí)間25 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間120 min，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得實(shí)際值為48.53 mg/g，與預(yù)期并無顯著性差異。通過對Svage 法除蛋白次數(shù)的簡單探究，得到使用Svage法7 次能使蛋白的去除率達(dá)到最大的同時(shí)多糖損失率最小。通過DEAE-52 纖維素柱層析柱對多糖溶液濃度梯度洗脫，可得到4 種組分多糖（CHP-1、CHP-2、CHP-3、CHP-4），并通過Sephadex G-100 層析柱驗(yàn)證其純度，壺瓶碎米薺粗多糖具有較好的體外抗氧化活性。