江曉梅 謝萬著 黃少君 嚴 瑤 曾文俊 唐紅珍 李芳梅

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530001，電子郵箱：1622232545@qq.com；2 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院皮膚科，南寧市 530001)

【提要】 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾是真核生物mRNA的修飾之一，是一個復雜的過程。多個m6A相關蛋白參與黑色素瘤發(fā)病的調(diào)控，這些蛋白對黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥有著重要的影響。本文對m6A修飾參與調(diào)控黑色素瘤的分子機制作一綜述，以期為黑色素瘤相關m6A修飾研究提供新的思路。

黑色素瘤是來源于黑素細胞、惡性病變程度較高的腫瘤，具有高度的侵襲性，且易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。近年來，黑色素瘤的發(fā)病率以3%～5%的年增長率迅速上升，且發(fā)病趨于年輕化，黑色素瘤病死例數(shù)占皮膚類癌病死總例數(shù)的65%以上[1]。大多數(shù)早期黑色素瘤患者的手術治愈率較高，但晚期患者預后較差，生存率較低[2]。探索黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥機制，對尋找新的診斷指標及治療方法具有重要意義。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修飾是指發(fā)生在mRNA、長非編碼RNA、轉(zhuǎn)移RNA等RNA的腺嘌呤上的甲基化修飾。m6A修飾為識別和調(diào)節(jié)RNA中的化學修飾，包括甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及甲基識別蛋白，通過調(diào)節(jié)RNA代謝、功能和定位對基因表達產(chǎn)生影響[3]。m6A修飾通過甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白實現(xiàn)甲基化[4]。近年來研究表明m6A修飾參與多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，其中m6A修飾可以通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的mRNA表達水平來影響腫瘤的發(fā)展[5]。目前m6A修飾調(diào)控黑色素瘤的相關研究仍然有限。本文對m6A修飾與黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關系，以及m6A修飾在腫瘤耐藥中的作用作一綜述，以期為黑色素瘤的治療提供新策略。

1 m6A修飾概述

m6A修飾是哺乳動物最常見的內(nèi)部RNA修飾，包括mRNA前體剪接、易位及穩(wěn)定性，從而調(diào)控mRNA的翻譯。m6A修飾由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶復合物催化，該復合物由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(methytransferase-like protein，METTL)3及其相互作用的蛋白組成，后者包括METTL14、剪接因子維爾姆斯瘤1相關蛋白(Wilms′tumor 1-associating protein,WTAP)、新蛋白[病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關蛋白(vir like m6A methyltransferase associated protein,VIRMA)]和其他尚未鑒定的蛋白。m6A的去除由RNA去甲基化酶脂肪量與肥胖相關蛋白(fat mass and obesity associated protein,FTO)以及烷基化DNA修復蛋白AlkB同系物(alkylated DNA repair protein AlkB homolog，ALKBH)5催化。m6A結(jié)合蛋白，即含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白[如含YTH結(jié)構(gòu)域的家族蛋白(YTH domain-containing family protein,YTHDF)1、YTHDF2和YTHDF3]可以特異性結(jié)合修飾的RNA并影響其穩(wěn)定性和翻譯。m6A修飾除了在干細胞分化、精子發(fā)生和應激反應等關鍵過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)核糖核酸代謝的生理作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也具有重要作用[6]。

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物可以催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)的甲基轉(zhuǎn)移至腺嘌呤第6位氮原子上，其中METTL3、METTL14定位在細胞核的亞細胞器—核小斑，并且間接調(diào)節(jié)WTAP，這是一種獨特的核定位模式[7]。研究顯示METTL3是一種SAM結(jié)合蛋白，是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合體的核心成分;其識別潛在的m6A位點，并將附著在SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到這些位點上，通過多種途徑影響癌癥的發(fā)生[8]。METTL14雖然與METTL3同源，但是缺少酶的催化結(jié)構(gòu)域，被認為是為提高METTL3催化活性提供RNA的結(jié)合平臺。WTAP也不具備酶的活性，其主要功能是幫助METTL3和METTL14復合體定位到核小斑[9]。然而METTL3作為最主要的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶,僅僅結(jié)合約22%的m6A位點[10]。隨著研究的深入，METTL16、ZC3H13、KIAA1429、 RBM15和CBLL1等甲基轉(zhuǎn)移酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[11]，并且在m6A修飾中起著重要作用。例如METTL16可結(jié)合于U6 snRNA，導致U6第43位的腺嘌呤發(fā)生m6A甲基化修飾，從而影響U6對mRNA前體的剪接[12]。

去甲基化酶主要由ALKBH家族組成，包括ALKBH1-8、FTO。ALKBH家族最突出的特點是依賴Fe2+和α-酮戊二酸結(jié)構(gòu)域進行底物催化[13]。有學者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO可通過調(diào)節(jié)mRNA的m6A的甲基化水平，影響mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過程[14]；ALKBH5對特定基因的m6A修飾位點去甲基化，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。

m6A修飾的閱讀蛋白主要包括YTHDF蛋白家族。m6A修飾在細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平的作用主要依靠YTHDF家族特殊的結(jié)合位點及其一些網(wǎng)絡機制來實現(xiàn)[5,15]，其中YTHDF1與YTHDF3的結(jié)合位點主要分布在mRNA的3′端非編碼區(qū)和終止密碼子[16-17]。既往觀點認為甲基化位點的轉(zhuǎn)化過程只要甲基化的底物轉(zhuǎn)錄發(fā)生甲基化，都可以被閱讀蛋白(YTHDF等)家族成員識別，并且m6A修飾的多種效應與甲基化位點不存在密切的聯(lián)系[18-19]。最近有研究結(jié)果顯示，對于甲基轉(zhuǎn)移酶的共有基序RRACH而言，其甲基化位點主要發(fā)生在終止密碼子周圍，但m6A特異位點聚集在5′端非編碼區(qū)至轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)域[20]。有實驗表明，m6A被閱讀蛋白酶YTHDF2識別后，通過選擇性地結(jié)合mRNA的衰減位點以影響mRNA的翻譯狀態(tài)和衰亡[21]。這些研究結(jié)果提示甲基化的特異位點與共有位點有所差異。此外，有學者發(fā)現(xiàn)某些mRNA能夠以相似的方式識別并結(jié)合YTHDF家族的3種同源蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)，3種同源蛋白可結(jié)合相同的mRNA以促進mRNA的翻譯和降解[22]。YTHDF1～3主要存在于細胞質(zhì)，其中YTHDF1在多種腫瘤中過度表達，免疫組織化學染色顯示其表達與多種惡性腫瘤行為有關，如腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等[3]。

2 m6A修飾與黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展之間的關系

目前，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展機制的生物學研究中，m6A修飾已成為研究熱點之一。在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展中，m6A修飾起著關鍵性的作用。m6A相關蛋白的異常表達可導致黑色素瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及耐藥。m6A修飾與黑色素瘤的主要關系見圖1。

圖1 黑色素瘤中的m6A修飾及其調(diào)節(jié)蛋白

2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶 黑色素瘤早期容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此針對m6A修飾如何調(diào)控腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、增殖進行研究有重要的意義。METTL3作為癌基因，在人類癌癥中起致癌和抑癌雙重作用，其可通過調(diào)節(jié)關鍵轉(zhuǎn)錄底物的m6A甲基化水平來促進多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[23]。例如，METTL3在人類肝細胞癌組織中表達顯著上調(diào)，且敲除METTL3可抑制體外培養(yǎng)的肝細胞癌細胞增殖，以及體內(nèi)致瘤性和肺轉(zhuǎn)移[24]。有學者發(fā)現(xiàn)，METTL3在人類黑色素瘤組織中表達上調(diào)，從而激活了基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2，促使c-Met、p-Akt蛋白的表達，導致黑色素瘤細胞集落形成，最終引起黑色素瘤細胞侵襲[25]。細胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-Met)是一種細胞表面酪氨酸激酶，是多種癌癥發(fā)生的驅(qū)動因子，除了受miRNA調(diào)節(jié)外，也直接受RNA m6A修飾的調(diào)控。有研究表明在罕見的黑色素瘤-葡萄膜黑色素瘤中，METTL3表達上調(diào)介導了c-Met/蛋白激酶B信號通路的激活從而影響葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖[11]。由此可見，METTL3可以促進黑色瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，因此敲除METTL3可抑制腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，而監(jiān)測METTL3的表達情況，對腫瘤的預后有著重要的意義。

2.2 去甲基化酶 FTO是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，表明m6A修飾的RNA甲基化是可逆的，且呈動態(tài)變化，因此具有重要的生理和病理功能[26]。FTO是黑色素瘤的一種原生因子，黑色素瘤中的FTO表達水平增加，機體通過自噬和核因子κB途徑誘導FTO表達，以及影響m6A RNA修飾及其去甲基化酶活性，從而調(diào)節(jié)其靶基因程序性死亡蛋白1(programmed death protein 1，PD-1)的表達，進而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在有關黑色素瘤的體外實驗研究中，敲除FTO基因后，機體可通過γ-干擾素調(diào)節(jié)組織中PD-1、C-X-C基序趨化因子受體4和SRY盒轉(zhuǎn)錄因子10的水平，誘導巨噬細胞對黑色素瘤細胞的殺傷作用，進而增強機體對抗PD-1阻斷的反應[27]。

此外，去甲基化酶ALKBH5的表達也與致癌或抑癌作用有關，例如，敲除ALKBH5可通過降低叉頭盒轉(zhuǎn)錄基因M1的m6A修飾水平來抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲；ALKBH5可通過改變Wnt抑制因子1的表達來抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移[28]。但ALKBH5在人類癌癥中的潛在機制尚未完全清楚[29]。在人黑色素瘤細胞中ALKBH5可調(diào)節(jié)靶基因單羥酸轉(zhuǎn)運蛋白4/單羥酸轉(zhuǎn)運蛋白3的表達和剪接，ALKBH5可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的乳酸濃度和血管內(nèi)皮生長因子α的積累來調(diào)節(jié)免疫抑制性骨髓間充質(zhì)干細胞和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的募集，從而促進腫瘤生長。

2.3 m6A結(jié)合蛋白 在黑色素瘤中，YTHDF1起到抑癌作用。HINT2是甲基識別蛋白家族的靶點，作為抑癌基因其可促進腫瘤細胞凋亡和死亡，經(jīng)YTHDF1的識別可以促進眼黑色素瘤抑制基因HINT2甲基化的翻譯過程，從而抑制細胞生長和遷移[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組織相比，眼黑色素瘤組織、細胞中HINT2 mRNA的m6A修飾減少，HINT2蛋白表達下調(diào)[30]。

3 m6A修飾與黑色素瘤耐藥性之間的關系

在黑色素瘤的治療中，耐藥是導致治療失敗的原因。最新研究表明m6A修飾在抗腫瘤的免疫治療中影響免疫反應和黑素瘤細胞敏感性[31]。深入研究m6A修飾與黑色素瘤耐藥的分子機制，可指導臨床用藥。

黑色素瘤細胞中METTL3/METTL14的缺陷促進了IFN-γ-Stat1-Irf1炎癥信號傳導，從而增加腫瘤微環(huán)境中的CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，以及IFN-γ、Cxcl9和Cxcl10趨化因子的分泌，增強黑色素瘤對抗PD-1治療的敏感性[32]。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5的缺失，導致了腫瘤微環(huán)境中乳酸鹽含量的變化，可以減少腫瘤疫苗GVAX/抗PD-1治療期間免疫細胞亞群的募集，提高GVAX/抗PD-1治療的功效。T淋巴細胞對腫瘤新抗原的自發(fā)啟動，有利于提高臨床免疫治療的效果。但許多患者體內(nèi)的新抗原識別能力不足以誘導持久的T淋巴細胞反應。有學者發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞中YTHDF1的缺失，增強了CD8+T淋巴細胞的主要抗原遞呈細胞，即樹突狀細胞的交叉啟動能力，促進T淋巴細胞識別腫瘤新抗原，從而啟動早期細胞免疫[34]。另有研究表明，YTHDF1蛋白高表達與腫瘤惡性程度有關，表達程度越高，則患者預后越差，敲除YTHDF1后，腫瘤細胞對氟尿嘧啶和奧沙利鉑的敏感性明顯增高[35]。但目前m6A結(jié)合蛋白與黑色素瘤免疫耐受之間關系的研究報告相對較少。

4 總結(jié)與展望

m6A修飾是mRNA中最常見的修飾，廣泛存在于真核生物，具有動態(tài)可逆性的特點，幾乎參與了mRNA的產(chǎn)生到降解的整個生物學過程。m6A修飾是一把“雙刃劍”，主要通過調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的mRNA水平來促進或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。它可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、分化，提高腫瘤細胞對放化療的敏感性。隨著對m6A作用機制研究的深入，其生物學過程或可被詳細揭示。但在黑色素瘤的發(fā)病中，m6A的甲基化功能和作用機制尚未完全清楚。進一步研究m6A的甲基化功能及其調(diào)控因子的分子機制，可以為黑色素瘤的臨床診斷和靶向治療提供依據(jù)。

免疫抑制劑在黑色素瘤的治療中取得了重大的突破，使越來越多的黑色素瘤患者受益，但耐藥性的出現(xiàn)又導致療效不佳。m6A修飾可經(jīng)過多條通路調(diào)控黑色素瘤對免疫抑制劑的耐藥性，m6A相關蛋白有可能成為控制腫瘤耐藥性的新靶點，且隨著新m6A修飾組分的發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化對腫瘤耐藥性的研究將得到進一步發(fā)展。