牛 越，王新茹，姚秀君，王君楚，包鴻慧

（1. 湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441000；2. 湖北保儂康血耳科技開(kāi)發(fā)有限公司，湖北 襄陽(yáng) 441600）

0 引言

免疫是人體重要的防御屏障，無(wú)論是對(duì)癌癥的預(yù)防，還是對(duì)新冠肺炎病毒的對(duì)抗，增強(qiáng)機(jī)體免疫力尤為關(guān)鍵[1]。血耳又名血銀耳，是一種傳統(tǒng)名貴藥食兼用珍稀食用菌，具有益氣活血，平肝陽(yáng)、去熱毒的功效，常用于婦科疾病、痢疾和急性肝炎等的治療[2-3]。多糖是食用菌中的主要活性成分，目前對(duì)血耳多糖的研究報(bào)道不多[4]，而對(duì)血耳免疫活性未見(jiàn)報(bào)道。采用熱水浸提法從血耳子實(shí)體中提取血耳多糖，研究其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫活性，為血耳資源的研究與開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

血耳，湖北保儂康血耳科技開(kāi)發(fā)有限公司提供，原料去雜，鼓風(fēng)干燥，打磨，過(guò)60 目篩，-20 ℃下保存；RPMI-1640 培養(yǎng)基（含胎牛血清），瑞士Roche 公司提供；水溶性四唑鹽（WST-1），美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），小鼠巨噬細(xì)胞；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

離子交換色譜，加拿大戴安公司產(chǎn)品；R200 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，瑞士BUCHI 公司產(chǎn)品；HC-3514 型離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司產(chǎn)品；EL-800 型酶聯(lián)檢測(cè)儀，美國(guó)BioTek 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血耳子實(shí)體多糖的提取

血耳粉末按料液比1∶10 沸水浸提2 h，冷卻，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮液按1∶4 乙醇沉淀，冰箱中4 ℃下過(guò)夜，離心取沉淀，經(jīng)復(fù)溶、透析、凍干，得血耳多糖。

1.3.2 血耳子實(shí)體多糖化學(xué)組成分析

含糖量測(cè)定采用硫酸苯酚法，蛋白含量測(cè)定選用lowry 法，單糖含量測(cè)定采用離子交換色譜法[5]。

1.3.3 血耳多糖對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用

取含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于96 孔培養(yǎng)板上接種人胃腺癌細(xì)胞（AGS）、結(jié)腸腺癌細(xì)胞（DLD-1） 和子宮頸癌細(xì)胞（HLa） 懸液，每孔200 μL 培養(yǎng)24 h（5%CO2、37 ℃），棄上清液，加入不同濃度梯度的不含小牛血清的血耳多糖樣品，培養(yǎng)48 h 后，加入WST-1，再培養(yǎng)4 h，于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定OD 值。癌細(xì)胞抑制率按照公式（1） 計(jì)算。

式中：As——試驗(yàn)組OD 值；

Ac——空白對(duì)照組OD 值。

1.3.4 血耳多糖對(duì)Raw264.7 的增殖作用

將巨噬細(xì)胞Raw264.7 和多糖溶液（100 μL） 放置于96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)72 h，于波長(zhǎng)405 nm 處測(cè)定吸光度。采用WST-1 法分析增殖作用，免疫細(xì)胞增殖率按照公式（2） 計(jì)算。

式中：As——實(shí)驗(yàn)組OD 值；

Ac——空白對(duì)照組OD 值。

1.3.5 血耳多糖對(duì)Raw264.7 分泌NO 分泌量的影響

將巨噬細(xì)胞（濃度為1×106cell/mL） 接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，棄上清液。添加不同濃度的TSP 溶液或LPS（1 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照），繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后取上清液，加入等體積的Griess試劑，避光下反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定吸光度。

1.3.6 血耳多糖對(duì)Raw264.7 免疫因子的影響

將不同濃度的多糖溶液及LPS 與巨噬細(xì)胞懸液混合，置于96 孔平板上培養(yǎng)48 h 后，用ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子（TNF-α、PGE2、IL-1β） 的表達(dá)量。每組多糖處理組為3 個(gè)重復(fù)。

1.3.7 血耳多糖對(duì)Raw264.7 免疫因子基因表達(dá)的影響

Raw264.7 中加入TSP 或LPS，置于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)18 h。收集細(xì)胞，用TRIzol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 提取總RNA。以提取的RNA 為模板，用oligo-(dT) 20 primer 和Superscript III RT（Invitrogen hCarlsbad hCA hUSA） 制備cDNA，再用PCR 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠圖像處理軟件掃描分析（Kodak Digital Science hKennesaw hGA hUSA）。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS 8.0 軟件分析，各試驗(yàn)組之間的差異用單因素方差分析（ANOVA） 和鄧肯氏復(fù)極差（Duncan's multiple-range test） 法進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 血耳多糖的化學(xué)組成

采用水提醇沉法提取血耳多糖，提取的血耳多糖含糖量為82.13%，含有少量蛋白（5.34%） 及灰分（6.05%），單糖組成表明，血耳多糖主要由葡萄糖（80.52%） 組成，含有少量半乳糖（19.48%）。Wang Zhaojing 等人[6]報(bào)道了血耳多糖TSPII 主要由甘露糖、木糖、半乳糖和葡萄糖組成，這主要是由于原料來(lái)源、提取純化和檢測(cè)方法不同。

血耳多糖的化學(xué)組成見(jiàn)表1。

表1 血耳多糖的化學(xué)組成/%

2.2 血耳多糖TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增率的影響

巨噬細(xì)胞在病原體和抗原的刺激下會(huì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答[7]。因此，試驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 為細(xì)胞模型，考查血耳多糖對(duì)Raw264.7 免疫增殖及細(xì)胞因子分泌的影響，為血耳多糖的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，含有血耳多糖的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，培養(yǎng)基清澈。

TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7 增殖率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7 增殖率的影響

加入TSP 后，小鼠巨噬細(xì)胞增殖率提高，且增殖率隨TSP 質(zhì)量濃度增加而增加，具有質(zhì)量濃度梯度關(guān)系，說(shuō)明TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 無(wú)細(xì)胞毒性，可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的增殖。

2.3 TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO 的影響

TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7 中NO 的影響見(jiàn)圖2。

圖2 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7 中NO 的影響

NO 的分泌是巨噬細(xì)胞激活的重要指標(biāo)，抗癌抗病毒等功能通過(guò)釋放NO 來(lái)實(shí)現(xiàn)[8]。TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO 的影響。由圖2 可知，TSP 能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞NO 的分泌，并呈現(xiàn)計(jì)量依賴(lài)關(guān)系。說(shuō)明TSP 是免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)活性。

2.4 TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

被激活的巨噬細(xì)胞能釋放大量的細(xì)胞因子，如TNF-α、PGE2 等。細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中起到了至關(guān)重要的作用，可以抗擊炎癥、抑制腫瘤等[9-12]。

TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中TNF-α 釋放的影響見(jiàn)圖3。

圖3 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中TNF-α 釋放的影響

在添加TSP 后，巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、PGE2、IL-1β 較陰性對(duì)照明顯增加（p＜0.01），且生成的細(xì)胞因子隨TSP 劑量的增加而增加，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中PGE-2 分泌量的影響見(jiàn)圖4，TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中IL-1β 分泌量的影響見(jiàn)圖5。

圖4 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中PGE-2 分泌量的影響

圖5 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中IL-1β 分泌量的影響

2.5 TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞iNOS、COX-2 的影響

TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中iNOS mRNA 表達(dá)的影響見(jiàn)圖6，TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中COX-2 mRNA 表達(dá)的影響見(jiàn)圖7。

圖6 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中iNOS mRNA 表達(dá)的影響

圖7 TSP 對(duì)巨噬細(xì)胞中COX-2 mRNA 表達(dá)的影響

iNOS 和COX-2 的表達(dá)由RT-PCR 方法檢測(cè)獲得。結(jié)果表明，小鼠巨噬細(xì)胞在與不同質(zhì)量濃度TSP培養(yǎng)后，相對(duì)于陰性對(duì)照組，多糖組的mRNA 表達(dá)顯著提高，并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。結(jié)果表明，TSP促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO 和PGE2 是通過(guò)iNOS 和COX-2 基因的表達(dá)完成的。

3 結(jié)論

沸水浸提法提取血耳多糖（TSP），TSP 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 具有顯著的刺激作用，具有免疫調(diào)節(jié)活性，可以作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用在食品和醫(yī)藥行業(yè)中。今后將進(jìn)一步研究血耳多糖免疫活性的構(gòu)效關(guān)系和免疫通路，以期為開(kāi)發(fā)血耳多糖保健助劑提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。