申開澤，萬(wàn)慶家，熊 宇，張應(yīng)龍，劉 莎

（1. 昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通 657000；2. 云南萬(wàn)綠生物股份有限公司，云南玉溪 653300）

免疫是機(jī)體至關(guān)重要的保護(hù)性生理功能，可有效識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，抵御外來(lái)病原微生物的入侵并清除體內(nèi)有害物質(zhì)，最終維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。免疫力下降，機(jī)體的抵抗能力也將隨之降低，從而引發(fā)疾病[1-2]。藥食兩用中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多層次免疫增強(qiáng)作用的優(yōu)勢(shì)[3]，因此是開發(fā)增強(qiáng)免疫功能產(chǎn)品的重要原料。庫(kù)拉索蘆薈（Aloe veraL.），主要含多糖、蒽醌、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素等成分，經(jīng)大量動(dòng)物功能試驗(yàn)研究證明具有較好的增強(qiáng)免疫力作用，有效用量折算為人體用量基本為每天1.2~3.0 g（以干物質(zhì)計(jì)，折算多糖含量約為0.12~0.30 g）[4-8]。綠茶中富含的茶多酚也具有明顯的增強(qiáng)免疫力作用[9-11]。維C 的增強(qiáng)免疫力功能也已得到動(dòng)物試驗(yàn)[12-13]和臨床試驗(yàn)[14-16]證實(shí)，同時(shí)維C 還是可根據(jù)生產(chǎn)需要適量添加的抗氧化食品添加劑。庫(kù)拉索蘆薈與茶多酚聯(lián)合使用能預(yù)防小鼠酒精性肝損傷[17]，庫(kù)拉索蘆薈還能促進(jìn)維C 在人體內(nèi)的吸收[18]，茶多酚與維C 有較好的協(xié)同作用[19]?；诖耍囼?yàn)以庫(kù)拉索蘆薈提取物、茶多酚和維C 為主要功能原料，以結(jié)晶果糖和羅漢果甜苷為輔料制成復(fù)配物，并探究其對(duì)小鼠免疫力的影響，以期為后續(xù)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)的藥效學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

庫(kù)拉索蘆薈提取物（200∶1），云南萬(wàn)綠生物股份有限公司提供；茶多酚（98%），江蘇德和生物科技有限公司提供；維C，東北制藥有限公司提供。3種功能原料復(fù)配結(jié)晶果糖和甜菊糖苷制成蘆薈茶多酚維C 復(fù)配物，口服推薦量為每日1 次，每次8 g（含蘆薈多糖0.15 g，茶多酚0.3 g，維C 0.1 g），折合體重劑量為0.133 g/kg·bw，（按60 kg 成人計(jì)）。

1.2 試驗(yàn)小鼠

采用體重為18~22 g 的SPF 級(jí)ICR 雌性小鼠，共200 只，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。試驗(yàn)期間的動(dòng)物生存環(huán)境溫度為20~25 ℃，相對(duì)濕度為54%~58%。

1.3 主要儀器與試劑

MS-TS 型分析天平、722S 型分光光度計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際有限公司產(chǎn)品；BBS-SDC 型潔凈工作臺(tái)，山東博科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiskan FC 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾公司產(chǎn)品；顯微鏡，上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

綿羊紅細(xì)胞（SRBC），北京博爾西科技有限公司提供；生理鹽水，上海百特醫(yī)療用品有限公司提供；Hank's 液，武漢卡諾斯科技有限公司提供；RPMI1640 培養(yǎng)液，武漢普諾賽公司提供；青鏈霉素，賽默飛世爾公司提供；刀豆球蛋白A（ConA）、Giemsa 染液，美國(guó)Sigma 公司提供；小牛血清，北京百奧萊博公司提供；1%冰醋酸、1 mol/L 的HCl 溶液、0.1%的碳酸鈉、磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS 緩沖液） （pH 值7.2~7.4），0.2 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液，實(shí)驗(yàn)室配制；SA 緩沖液、雞紅細(xì)胞、補(bǔ)體（豚鼠血清）、MTT、 YAC-1 細(xì)胞、都氏試劑、瓊脂糖、2.5% Triton，上海源葉生物科技有限公司提供；酸性異丙醇、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I、甲醇（分析純），廣東光華科技股份有限公司提供；印度墨汁，上海哈靈生物科技有限公司提供。

1.4 樣品劑量選擇和前處理

分別按人體推薦量的5 倍，10 倍和30 倍設(shè)0.67，1.33，4.00 g/kg·bw 3 個(gè)劑量組（低、中、高）。分別取復(fù)配物6.70，13.30，40.00 g，用蒸餾水配制至200 mL，即得。

1.5 試驗(yàn)方法

參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003 版）》[20]，將小鼠平均分為A~E 5 個(gè)大組，A 組開展碳廓清試驗(yàn)；B 組采用MTT 法開展ConA 誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行NK 細(xì)胞的活性測(cè)試；C 組開展臟/體比值、半數(shù)溶血值（HC50） 和抗體生成細(xì)胞數(shù)測(cè)定；D 組采用足跖腫脹法進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（Delayed type hypersensitivity，DTH） 試驗(yàn)；E 組開展小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。每個(gè)大組隨機(jī)分為4 個(gè)小組（每組10 只），即3 個(gè)劑量組和1 個(gè)對(duì)照組。各小組按20 mL/kg·bw 對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，對(duì)照組用等量的蒸餾水，每日1 次，持續(xù)30 d。數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計(jì)分析采用Excel，SPSS 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配物對(duì)試驗(yàn)小鼠體重的影響

與對(duì)照組相比，5 個(gè)大組中的低中高各劑量組在試驗(yàn)初期、中期和末期的小鼠體重及試驗(yàn)期間體重增長(zhǎng)，均無(wú)顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明復(fù)配物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物體重及增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

2.2 復(fù)配物對(duì)試驗(yàn)小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

復(fù)配物對(duì)小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響見(jiàn)表1。

表1 復(fù)配物對(duì)小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響（±s）/%

表1 復(fù)配物對(duì)小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響（±s）/%

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由表1 可知，與對(duì)照組相比，各劑量對(duì)小鼠胸腺/ 體重比值和脾臟/ 體重比值無(wú)顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明受試物對(duì)試驗(yàn)小鼠的免疫器官臟器/體重比值無(wú)明顯影響。

2.3 復(fù)配物對(duì)試驗(yàn)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

復(fù)配物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力的影響見(jiàn)表2。

表2 復(fù)配物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力的影晌（±s）

表2 復(fù)配物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力的影晌（±s）

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由表2 可知，以足跖腫脹法進(jìn)行的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力試驗(yàn)結(jié)果表明，l.33 g/kg·bw 和4.00 g/kg·bw劑量組的小鼠足跖腫脹度與對(duì)照組相比具有顯著性差異（p＜0.05），表明復(fù)配物具有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫的功能。但復(fù)配物各劑量組的OD（optical density）差值與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明復(fù)配物不能明顯改善小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力。

2.4 復(fù)配物對(duì)小鼠體液免疫的影響

復(fù)配物對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和HC50的影響見(jiàn)表3。

由表3 可知，采用Jerne 玻片改良法進(jìn)行小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)檢測(cè)，結(jié)果表明，高劑量組的溶血空斑數(shù)與對(duì)照組相比具有顯著性差異（p＜0.05）。該劑量組的小鼠半數(shù)溶血值（HC50） 與對(duì)照組比較也顯著提高（p＜0.05）。2 項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果綜合說(shuō)明復(fù)配物能顯著增強(qiáng)試驗(yàn)小鼠的體液免疫。

表3 復(fù)配物對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和HC50 的影響（±s）

表3 復(fù)配物對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和HC50 的影響（±s）

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2.5 復(fù)配物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

復(fù)配物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清和對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬率的影響見(jiàn)表4。

表4 復(fù)配物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清和對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬率的影響（±s）

表4 復(fù)配物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清和對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬率的影響（±s）

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由表4 可知，小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能影響試驗(yàn)以吞噬指數(shù)（a） 來(lái)表示復(fù)配物對(duì)碳廓清能力，與對(duì)照組比較，復(fù)配物各劑量組吞噬指數(shù)統(tǒng)計(jì)均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。同樣，小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)也顯示，各劑量組的吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比也無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)果表明，復(fù)配物不能明顯增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

2.6 復(fù)配物對(duì)小鼠NK 細(xì)胞活性的影響

復(fù)配物對(duì)小鼠NK 細(xì)胞活性的影響見(jiàn)表5。

表5 復(fù)配物對(duì)小鼠NK 細(xì)胞活性的影響（±s）

表5 復(fù)配物對(duì)小鼠NK 細(xì)胞活性的影響（±s）

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由表5 可知，各劑量組NK 細(xì)胞活性均高于對(duì)照組，并隨劑量增高呈一定的遞增關(guān)系，中、高劑量組與對(duì)照組比較有顯著性差異（p＜0.05），表明復(fù)配物有顯著提高小鼠NK 細(xì)胞活性的作用。

3 結(jié)論

以小鼠為對(duì)象全面開展蘆薈茶多酚維C 復(fù)配物的增強(qiáng)免疫力功能動(dòng)物試驗(yàn)。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，連續(xù)30 d 每天一次經(jīng)口灌胃給予小鼠0.67，1.33，4.00 g/kg·bw 劑量的復(fù)配物，各劑量對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)、胸腺/ 體重比值、脾臟/ 體重比值無(wú)顯著影響，說(shuō)明樣品對(duì)小鼠體重和免疫器官無(wú)明顯影響；同時(shí)，1.33，4.00 g/kg·bw 劑量能顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力和NK 細(xì)胞活性（p＜0.05），4.00 g/kg·bw 劑量能顯著提高抗體生成細(xì)胞數(shù)和小鼠半數(shù)溶血值（p＜0.05）。體液免疫功能和NK 細(xì)胞活性呈陽(yáng)性，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)[20]，可以判定庫(kù)拉索蘆薈提取物復(fù)配茶多酚和維C 具有增強(qiáng)免疫力功能。為以庫(kù)拉索蘆薈、茶多酚和維C 為功能原料進(jìn)行增強(qiáng)免疫力功能保健食品的開發(fā)提供了理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。為了進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，后續(xù)開展體外機(jī)制研究、體內(nèi)藥理學(xué)十分必要，還應(yīng)開展多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照人體試食研究，以進(jìn)一步確證其功能。