李裕軍，陳婕婷，胡纓賢，馬淑媚，王延?xùn)|

(中山大學(xué)中山眼科中心，眼科學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，藥學(xué)部，廣州 510060)

電光性眼炎是角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜吸收大量而強(qiáng)烈的紫外線所引起的急性無菌性炎癥，是臨床上最常見的輻射性眼病之一。在臨床治療上先用鹽酸丁卡因滴眼液等表面麻醉劑解除眼瞼痙攣并進(jìn)行下一步治療[1-3]。

鹽酸丁卡因滴眼液是臨床上常用的局部麻醉劑，其主要成分為鹽酸丁卡因、氯化鈉和羥苯乙酯等。常用的羥苯乙酯含量測定方法為紫外分光光度法，鹽酸丁卡因的含量測定方法通常為永停滴定法、紫外-可見分光光度法等[4-6]。相對比上述方法，高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)更加準(zhǔn)確高效。因此，筆者開發(fā)了一種高效液相色譜法同時測定鹽酸丁卡因滴眼液中鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量，為鹽酸丁卡因滴眼液的質(zhì)量檢驗和控制提供了更簡便、更精確、更高效的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1100，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器等)；BT-125D型電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥

羥苯乙酯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100847-201604，含量99.9%)，鹽酸丁卡因?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號100456-201602，含量100.0%)，鹽酸丁卡因滴眼液(規(guī)格10 mL:50 mg，批號161128、161129、161130，中山大學(xué)中山眼科中心制劑室)，乙腈為色譜純，三乙胺和冰醋酸為分析純，水為注射用水。

1.3 色譜條件

采用Agilent Eclipse PLUS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以1%三乙胺溶液(三乙胺10 mL，加水990 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.5)-乙腈(65:35，V/V)為流動相，流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為256 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 鹽酸丁卡因?qū)φ掌穬湟?/p>

精密稱取鹽酸丁卡因?qū)φ掌?5.79 mg置于10 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.4.2 羥苯乙酯對照品儲備液

精密稱取羥苯乙酯對照品15.12 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加適量熱水溶解，用水稀釋至刻度，搖勻。

1.4.3 混合對照品溶液

精密量取鹽酸丁卡因?qū)φ掌穬湟汉土u苯乙酯對照品儲備液各1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.258 mg/mL的鹽酸丁卡因溶液和0.015 mg/mL的羥苯乙酯溶液。

1.4.4 供試品溶液

精密量取供試品5 mL，置于100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

1.4.5 陰性樣品溶液

精密量取缺鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的陰性樣品5 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻。

1.5 方法學(xué)驗證

1.5.1 專屬性試驗

取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.5.2 線性與范圍

精密稱取鹽酸丁卡因?qū)φ掌泛土u苯乙酯對照品適量，用水溶解并稀釋制成濃度為含鹽酸丁卡因2.579 mg/mL和羥苯乙酯0.150 mg/mL的混合對照品儲備液，精密量取混合對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4 mL置于10 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成含鹽酸丁卡因0.05、0.10、0.15、0.21、0.26、0.36 mg/mL和含羥苯乙酯3.02、6.04、9.06、12.08、15.10、21.14 μg/mL的系列濃度溶液。精密量取各溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積并記錄色譜圖。

1.5.3 精密度

分別取混合對照品溶液和供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積并記錄色譜圖。

1.5.4 加樣回收率試驗

分別精密稱取鹽酸丁卡因原料適量，分別配制約為規(guī)定量80%、100%、120%的回收率測定溶液各3份，共9份，按照處方比例加入輔料，制備供試品溶液，并進(jìn)樣測定峰面積，計算樣品中鹽酸丁卡因的含量和回收率。

分別精密稱取羥苯乙酯適量，分別配制約為規(guī)定量80%、100%、120%的回收率測定溶液各3份，共9份，按照處方比例加入輔料，制備供試品溶液，并進(jìn)樣測定峰面積，計算樣品中羥苯乙酯的含量和回收率。

1.5.5 溶液穩(wěn)定性

分別取供試品溶液和混合對照品溶液，置室溫放置，在0、2、4、8、12、24 h時進(jìn)樣，測定鹽酸丁卡因和羥苯乙酯峰面積，計算鹽酸丁卡因和羥苯乙酯含量。

1.5.6 耐用性試驗

在試驗中對柱溫、流速進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，分別測定鹽酸丁卡因滴眼液中鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量，以考察方法的耐用性。其他色譜條件不變，分別在柱溫為25、30、35 ℃及流速為0.8、1.0、1.2 mL/min條件下進(jìn)行實驗，記錄鹽酸丁卡因峰和羥苯乙酯峰的保留時間并計算各色譜條件下的鹽酸丁卡因和羥苯乙酯含量。

1.5.7 樣品含量測定

取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，測定峰面積并記錄色譜圖，計算鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量。鹽酸丁卡因的含量按外標(biāo)法以峰面積計算，應(yīng)為標(biāo)示量的93.0%～107.0%。羥苯乙酯的含量按外標(biāo)法以峰面積計算，應(yīng)為標(biāo)示量的80.0%～120.0%。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

供試品溶液色譜圖中，與對照品溶液中羥苯乙酯峰和鹽酸丁卡因峰相同保留時間處，有相同的峰，且峰形對稱，無相鄰雜質(zhì)峰。陰性樣品溶液色譜圖中無與鹽酸丁卡因峰和羥苯乙酯峰相同保留時間的峰出現(xiàn)，即其他輔料無干擾(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatography chromatograms

2.2 線性與范圍

鹽酸丁卡因線性：以鹽酸丁卡因濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性回歸方程為A=3672.344C+12.242，r=1.000。結(jié)果表明鹽酸丁卡因在0.05～0.36 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(表1)。

表1 鹽酸丁卡因線性與范圍Table 1 Linear and range of tetracaine hydrochloride

羥苯乙酯線性：以羥苯乙酯濃度(C)為縱坐標(biāo)，峰面積(A)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性回歸方程為A=109.224C+12.596，r=1.000。結(jié)果表明羥苯乙酯在3.02～24.14 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(表2)。

表2 羥苯乙酯線性與范圍Table 2 Linear and range of ethyl hydroxybenzoate

2.3 精密度

取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計算，結(jié)果鹽酸丁卡因峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.2%(n=6)。羥苯乙酯峰面積的RSD為0.1%(n=6)，另取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計算，鹽酸丁卡因峰面積RSD為0.3%(n=6)。羥苯乙酯的峰面積RSD為0.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4 加樣回收率試驗

9份供試品溶液的鹽酸丁卡因的平均回收率為99.2%，RSD為0.3%(n=9)。結(jié)果如表3所示。

表3 鹽酸丁卡因回收率實驗結(jié)果Table 3 Results of adding tetracaine hydrochloride recovery

9份供試品溶液的羥苯乙酯的平均回收率為98.2%，RSD為0.4%(n=9)。結(jié)果如表4所示。

表4 羥苯乙酯加樣回收率實驗結(jié)果Table 4 Results of adding ethyl hydrobenzoate recovery

3個濃度下鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的平均回收率均為97.7%～99.6%，9個回收率數(shù)據(jù)的RSD均小于2.0%，表明含量測定方法可靠。

2.5 溶液穩(wěn)定性

6個時間點(diǎn)下鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量RSD為0.7%和0.6%，表明在室溫條件下對照品溶液和供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 耐用性試驗

耐用性試驗結(jié)果表示：柱溫和流速對鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量測定結(jié)果影響較小，結(jié)果如表5所示。

表5 耐用性試驗結(jié)果Table 5 Results of durability test

2.7 樣品含量測定

三批制劑檢測結(jié)果見表4，鹽酸丁卡因含量均在標(biāo)示量93.0%～107.0%的范圍內(nèi)，羥苯乙酯含量均在標(biāo)示量80.0%～120.0%的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果如表6所示。

表6 三批鹽酸丁卡因滴眼液的含量測定結(jié)果Table 6 Three batches analysis results of tetracaine hydrochloride eye drops

3 討論

鹽酸丁卡因滴眼液為局部麻醉劑，根據(jù)《中國藥典》二部，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定方法為永停滴定法[7]。該法準(zhǔn)確性差，誤差大，測量結(jié)果較實際含量偏低，不能滿足基層醫(yī)院制劑快速檢測的需要，同時比較紫外可見分光光度法和酸堿滴定法，高效液相色譜法測定的結(jié)果更為準(zhǔn)確可行[8]。鹽酸丁卡因滴眼液屬于無菌制劑，為保證制劑不被微生物污染，因此制劑中一般都會添加適量的羥苯乙酯[9-10]。傳統(tǒng)的羥苯乙酯含量檢測方法為紫外分光光度法，該方法誤差較大、穩(wěn)定性差。經(jīng)筆者結(jié)合鹽酸丁卡因含量測定的需要，參考相關(guān)研究，開發(fā)了一種HPLC同時檢測鹽酸丁卡因和羥苯乙酯兩種組分的含量[11-16]。

通過方法學(xué)試驗驗證和3批樣品的含量測定，該測定方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。能夠準(zhǔn)確有效地對鹽酸丁卡因滴眼液中鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量進(jìn)行檢驗和控制。

相較于以往的永停滴定法、紫外分光光度法及酸堿滴定法等測定鹽酸丁卡因的含量，HPLC具備更精確、更直觀的結(jié)果顯示，減少了人為的影響和系統(tǒng)誤差，使得結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，在國家對藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范不斷加強(qiáng)的今天，更符合黨和國家對藥品質(zhì)量要求的趨勢和期望；同時相較于以往使用不同的分析方法對鹽酸丁卡因和羥苯乙酯的含量進(jìn)行分別測定，筆者開發(fā)的一種對該制劑中兩種組分含量的測定方法[17-20]，脫離了原來繁瑣的配樣過程和實驗準(zhǔn)備，實現(xiàn)了檢驗的半自動化，用更少的試劑、更簡捷的配樣操作、更直觀的結(jié)果進(jìn)一步為鹽酸丁卡因滴眼液的質(zhì)量檢驗提供了更便捷、高效的方法，是廣大藥品檢驗工作者的一大福利。與此同時，該方法的實際應(yīng)用也為生產(chǎn)企業(yè)降低了生產(chǎn)和檢驗等制藥成本，減輕了百姓藥品費(fèi)用的負(fù)擔(dān)，同時也為醫(yī)生和患者安全有效地用藥提供了更準(zhǔn)確可靠的依據(jù)。

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