鄧濤 ，周建花 ，馬寧，劉京，呂傳碩，張國(guó)梅，周蓉，樂(lè)洋，張家友，楊曉明

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢 430207；2.國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430207；3.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029

禽類是A 型H5N1 流感病毒的天然宿主，但已證實(shí)該病毒可打破物種屏障，在不同宿主甚至人與人之間傳播，具有大流行潛力［1-2］。據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，2003 — 2018 年全球報(bào)告H5N1 確診病例共860例，其中死亡病例454 例，死亡率超過(guò)50%［3］。雖然H5N1 在人群中的確診病例較少，但極高的死亡率讓人們不得不采取預(yù)防措施。接種疫苗是預(yù)防控制流感的有效措施。目前流感疫苗主要成分為流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA），但HA 常發(fā)生抗原漂移（antigenic drift）和／ 或抗原轉(zhuǎn)換（antigenic shift），造成疫苗毒株的抗原性與流行毒株不匹配［4-5］，從而導(dǎo)致目前的流感疫苗不能有效預(yù)防季節(jié)性和大流行性流感。據(jù)報(bào)道，全球范圍內(nèi)季節(jié)性流感疫苗效力僅為10% ～60%，大流行性流感疫苗保護(hù)率則可能更低［6-7］。

流感病毒表面另一種主要糖蛋白為神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）。NA 是由4 個(gè)完全相同的單體通過(guò)非共價(jià)結(jié)合形成的蘑菇狀四聚體，A 型流感病毒根據(jù)NA 抗原性分為11 個(gè)亞型（N1 ～ N11），B 型和C 型流感病毒NA 不分亞型［8］。NA 是流感病毒傳播所必需的蛋白之一，其通過(guò)水解宿主細(xì)胞膜上的病毒唾液酸受體，從而破壞連接病毒與細(xì)胞之間、病毒與病毒之間的唾液酸糖蛋白，防止子代病毒在細(xì)胞表面聚集，促進(jìn)病毒顆粒釋放，從而使整個(gè)病毒復(fù)制周期順利完成［8-10］。研究表明，NA 的年突變率低于HA，分別為0.45% ～ 1.01%和1% ～ 2%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HA 和NA 的抗原變化是相互獨(dú)立的［11］。因此，當(dāng)HA 發(fā)生抗原漂移時(shí)，使用NA 免疫可能提供一定程度的保護(hù)。還有研究表明，自然感染和免疫接種產(chǎn)生的NA 特異性抗體均具有獨(dú)立的保護(hù)作用［12］。在動(dòng)物模型中，NA 特異性抗體可防止致命流感病毒的攻擊，并與肺部病毒滴度呈負(fù)相關(guān)［13-16］。此外，豚鼠的NA 疫苗接種可防止病毒在豚鼠間傳播［17］。更重要的是，在人類挑戰(zhàn)性研究中，NA 特異性抗體與機(jī)體感染程度呈負(fù)相關(guān)［18-20］。

本研究基于前期建立的流感疫苗NA 的分離純化方法（磁珠法）［21］，對(duì)制備的H5N1 型流感病毒裂解疫苗原液進(jìn)行分離純化獲得H5N1 NA 純蛋白，免疫BLAB／c 小鼠，并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)NA 的免疫原性和免疫保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 病毒和雞胚 病毒A／reassortant／NIBRG-14（Viet NAm／1194／2004 × Puerto Rico／8／1934，H5N1）工作種子批（代次：3 代）由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究二室提供，批號(hào)：202101W01H5；8 ～ 10 日齡SPF 級(jí)雞胚由該公司流感疫苗室提供。

1.2 主要試劑及儀器 TritonX-100（貨號(hào)：T8787）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（貨號(hào)：D110087）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；10 kD 超濾管（貨號(hào)：MRCPRT010）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；TMB 顯色底物（貨號(hào)：421101）購(gòu)自美國(guó)Bio-Legend 公司；PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：A53225）、預(yù)染蛋白marker（貨號(hào)：26617）、Multiskan FC 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；12% SDSPAGE 預(yù)制膠（貨號(hào)：M01215C）、Tris-MOPS-SDS（貨號(hào)：M00138）、4 × SDS 上樣緩沖液（貨號(hào)：M00676）購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；MF59 佐劑購(gòu)自湖北葛店人福藥用輔料有限責(zé)任公司；普通96 孔酶標(biāo)板（貨號(hào)：42592）購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；非接觸式紅外體溫計(jì)購(gòu)自廣州市倍爾康醫(yī)療器械有限公司。1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB／c 小鼠，雌性，6 ～ 8周齡，體重16 ～ 18 g，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供并飼養(yǎng)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0013，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2014-0012。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.4 H5N1 型流感病毒裂解疫苗原液的制備及NA的分離純化 將-80 ℃儲(chǔ)存的H5N1 型流感病毒工作種子批室溫解凍后接種至雞胚，每個(gè)雞胚加入100 μL病毒液，37 ℃培養(yǎng)72 h 后，置4 ℃冰箱8 h 冷胚；收獲尿囊液，1000×g 離心10 min，去除沉淀雜質(zhì)，使用10 kD 超濾離心管760 × g 離心10 min，濃縮病毒收獲液，置56 ℃滅活病毒1 h；使用0.5% TritonX-100室溫裂解病毒3 h，獲得H5N1 型流感病毒裂解疫苗原液。采用本研究前期建立的磁珠法［21］分離純化H5N1 NA，12% SDS-PAGE 分析NA 純度，BCA 法測(cè)定NA 蛋白濃度。

1.5 動(dòng)物分組及免疫 將BALB／c 小鼠隨機(jī)分為7組：2 μg NA、10 μg NA、50 μg NA、2 μg NA + MF59、10 μg NA + MF59、50 μg NA + MF59 和MF59 組，每組10 只。MF59 佐劑濃度為100 μg／mL，按體積1 ∶1 與NA 混合均勻后肌內(nèi)注射。初次免疫2 周后，相同程序／ 劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫2 周后眼眶后靜脈叢采血分離血清，置37 ℃2 h 后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 血清效價(jià)檢測(cè) 采用ELISA 法。用0.05 mol／L 碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋H5N1 NA 至0.5 μg／mL，4 ℃包被過(guò)夜；洗滌拍干，加入200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600 倍稀釋的血清，100 μL／孔，37 ℃孵育1 h；洗滌拍干，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1 ∶25000 稀釋），100 μL／孔，37 ℃孵育1 h；洗滌拍干，加入顯色液，100 μL／孔，室溫避光顯色15 min；加入2 mol／L H2SO4溶液，50 μL／孔，終止顯色；使用酶標(biāo)儀測(cè)定A450值，cut-off 值定義為PBS測(cè)定A450的2.1 倍，高于cut-off 值的最大稀釋倍數(shù)為相應(yīng)血清抗體的效價(jià)。

1.7 體內(nèi)保護(hù)效果評(píng)價(jià) 于加強(qiáng)免疫后3 周對(duì)BALB／c小鼠進(jìn)行攻毒。將10-3.5CCID50／0.1 mL 的H5N1型病毒對(duì)小鼠進(jìn)行滴鼻，100 μL／只，監(jiān)測(cè)小鼠攻毒后2 周內(nèi)體重和體溫變化，同時(shí)觀察臨床癥狀并記錄評(píng)分。小鼠體重減輕超過(guò)攻毒前體重的25%，定義為死亡［22］。使用非接觸式紅外體溫計(jì)測(cè)定小鼠腹部體溫，每只小鼠重復(fù)3 次，取均值。臨床評(píng)分參考GONZALEZ 等［22］所述，即小鼠在以下4 種情況中的每一種情況的嚴(yán)重程度評(píng)分（無(wú)／ 0 分、輕微／ 1分、中等／ 2 分、嚴(yán)重／ 3 分）：皮毛褶皺／ 豎毛、嗜睡／蜷縮不好動(dòng)、瘦弱／ 駝背和呼吸困難，每日記錄小鼠的臨床癥狀評(píng)分。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均數(shù)采用非配對(duì)的t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NA 的純度及濃度 純化的NA 經(jīng)12% SDSPAGE 分析，純度為90%，見(jiàn)圖1。純化后NA 濃度為201.23 μg／mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 磁珠法純化H5N1 NA 的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE profile of H5N1 NA purified with magnetic beads

圖2 BCA 法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of BCA

2.2 NA 特異性抗體效價(jià) 2 μg NA、10 μg NA、50 μg NA、2 μg NA+MF59、10 μg NA+MF59、50 μg NA +MF59 和MF59 組抗體平均效價(jià)分別為20000、40000、73600、46400、38400、121600、400，各劑量組血清效價(jià)呈劑量依賴性，2、10、50 μg NA+MF59組血清效價(jià)均高于相應(yīng)未加佐劑的2、10、50 μg NA組（t 分別為2.611、4.254 和2.835；P 均< 0.05），見(jiàn)圖3。50 μg NA + MF59 組效價(jià)最高，因此，后續(xù)選擇該組隨機(jī)8 只小鼠和MF59 組隨機(jī)8 只小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

圖3 血清抗體效價(jià)ELISA 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 ELISA of serum antibody titer

2.3 體內(nèi)保護(hù)效果 與攻毒前1 天小鼠體重比較，MF59 組小鼠體重從攻毒后開(kāi)始下降，至攻毒后第6天平均體重變化率下降至最低后逐漸恢復(fù)，而50 μg NA+MF59 組小鼠體重未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖4。MF59組攻毒后導(dǎo)致50%小鼠（4 只）死亡，而50 μg NA +MF59 能保護(hù)100%（8 只）小鼠免受同種病毒致命攻擊，見(jiàn)圖5。

圖4 攻毒后小鼠體重變化Fig.4 Change of body weight of mice after challenge

圖5 H5N1 攻毒后小鼠生存曲線Fig.5 Survival curve of mice after challenge with H5N1 influenza virus

攻毒后臨床癥狀監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫NA 能夠減輕小鼠感染H5N1 后的臨床癥狀，見(jiàn)圖6。兩組小鼠體溫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.8691，P > 0.05），見(jiàn)圖7。

圖6 H5N1 攻毒后小鼠臨床癥狀評(píng)分Fig.6 Scores for clinical symptom of mice after challenge with H5N1 influenza virus

圖7 H5N1 攻毒后小鼠體溫變化Fig.7 Change of body temperature of mice after challenge with H5N1 influenza virus

3 討論

H5N1 跨越物種傳播的能力，以及毒性的增強(qiáng)，對(duì)制定明確的戰(zhàn)略以防止這一高致病性禽流感病毒的大流行提出了挑戰(zhàn)［23］。當(dāng)前流感疫苗研究仍集中在HA 上，但由于HA 存在的抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致目前的流感疫苗保護(hù)效力并不理想。研究表明，無(wú)論自然感染還是免疫接種誘導(dǎo)產(chǎn)生的NA抗體均具有獨(dú)立的保護(hù)作用［12］。在臨床前研究中，使用NA 免疫的動(dòng)物可抵抗致死劑量流感病毒的攻毒挑戰(zhàn)［15-16］。此外，人體的NA 特異性免疫反應(yīng)也與保護(hù)受試者免受病毒感染有關(guān)［19-20］。因此本實(shí)驗(yàn)著重研究了物理方法純化的H5N1 NA 的免疫原性，并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

MF59 是一種水包油乳劑，其是將吐溫80、山梨糖醇三油酸酯和角鯊烯混合后于高壓條件下進(jìn)行微流化形成的均一的小滴狀乳液。MF59 也是目前唯一用于商用流感疫苗的佐劑，能夠增強(qiáng)免疫力低下人群對(duì)流感疫苗的免疫原性［24］。本研究使用MF59佐劑相同劑量免疫2 次后，加MF59 相應(yīng)劑量組的滴度均遠(yuǎn)高于相應(yīng)未加MF59 劑量組，最高滴度組（50 μg NA + MF59 組）平均滴度達(dá)121600。磁珠法純化的NA 免疫BALB／c 小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體呈劑量依賴性，使用MF59 佐劑組能提高抗體滴度。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，50 μg NA + MF59 組小鼠平均體重在第5 天觀察到輕微下降，而MF59 組小鼠平均體重從攻毒后第2 天開(kāi)始下降，第6 天最低，第7 天開(kāi)始升高。MF59 組組內(nèi)差異較大，表明不同小鼠因個(gè)體差異，對(duì)H5N1 反應(yīng)有所不同。MF59 組有50%小鼠死亡，而50 μg NA + MF59 組100%保護(hù)H5N1攻擊。我們同時(shí)還監(jiān)測(cè)了臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)免疫NA與純佐劑組比較，能夠有效減輕H5N1 攻毒后臨床癥狀。但未觀察到體溫變化差異，與BELSER 等［25］報(bào)道一致，小鼠在流感病毒感染后不會(huì)發(fā)熱或出現(xiàn)易于測(cè)量的呼吸道臨床癥狀。

綜上所述，免疫磁珠法純化的H5N1 NA 在BALB／c小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生NA 特異性抗體，MF59 佐劑能夠顯著提高抗體效價(jià)。免疫H5N1 NA + MF59 能夠保護(hù)BALB／c 小鼠受到H5N1 攻擊，還能明顯減輕臨床癥狀。