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姜黃素協(xié)同米托蒽醌對小鼠TC-1 腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用及其作為腫瘤疫苗的潛力

2022-05-28 07:20楊穎楊英胡永茂劉清文馬雁冰
中國生物制品學(xué)雜志 2022年5期
關(guān)鍵詞:脾臟誘導(dǎo)小鼠

楊穎,楊英,胡永茂,劉清文,馬雁冰

1.昆明醫(yī)科大學(xué),云南昆明 650500;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南 昆明 650000;3.云南大學(xué),云南 昆明 650000

宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性第三大常見癌癥,每年約有529800 例新發(fā)病例和275100 例死亡病例[1-2]。在世界范圍內(nèi),宮頸癌是僅次于乳腺癌的女性癌癥死亡原因,嚴(yán)重危害全球女性健康。人乳頭瘤狀病毒(human papillomavirus,HPV)已經(jīng)被確定為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要致病因素,尤其是高危型別的HPV,如16、18、31 和33 型等。近年來隨著HPV預(yù)防性疫苗的上市及接種,宮頸癌發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)地區(qū)呈現(xiàn)明顯下降趨勢。然而在較多發(fā)展中和落后地區(qū),昂貴的HPV 多價疫苗目前尚無法實現(xiàn)普遍接種,因此宮頸癌仍嚴(yán)重威脅女性健康。由于現(xiàn)有的預(yù)防性疫苗對已有的持續(xù)感染和由此引發(fā)的宮頸癌無治療效果,目前仍然存在大量因HPV 感染而患宮頸癌的人群。

近年來,腫瘤免疫治療已成為腫瘤研究及臨床應(yīng)用的熱點,正在改變腫瘤治療的新格局,并且發(fā)展十分迅速。其宗旨在于減輕免疫抑制作用或激活、增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)正常的抗腫瘤免疫功能,依靠自身的免疫機(jī)能殺傷腫瘤細(xì)胞。目前腫瘤臨床免疫治療面臨的挑戰(zhàn)主要為:腫瘤細(xì)胞的低免疫原性;腫瘤抑制性免疫微環(huán)境的存在;腫瘤形成的一系列免疫逃逸機(jī)制使機(jī)體免疫系統(tǒng)無法發(fā)揮正常抗腫瘤作用。

免疫原性細(xì)胞死亡(immunogenic cell death,ICD)通過釋放腫瘤抗原并暴露“危險信號”以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[3-4]。其特點是釋放和/ 或增加表達(dá)損傷相關(guān)的分子模式(danger associated molecular patterns,DAMPs)、前體抗原炎性細(xì)胞因子[4]和炎性介質(zhì)。主要的DAMPs 包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CALR)、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein B1,HMGB1)、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)、Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)和膜聯(lián)蛋白1(Annexin 1,ANXA1)等,繼而激活和募集抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)后活化T 細(xì)胞,產(chǎn)生針對腫瘤抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]。DAMPs 與模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)結(jié)合后引起一系列事件。如腫瘤細(xì)胞釋放至胞外的ATP作為“發(fā)現(xiàn)我”的信號,具有招募、激活A(yù)PCs 和激活炎性體通路的雙重作用。細(xì)胞膜表面暴露的鈣網(wǎng)蛋白(ecto-CALR)作為一個強(qiáng)有力的“吃掉我”信號,能增強(qiáng)APCs 對死亡癌細(xì)胞的免疫原性識別和吞噬[6]。提示誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 有潛在的腫瘤治療作用。

化療和放療能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 從而賦予腫瘤細(xì)胞免疫原性,加強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的識別和清除。盡管這些誘導(dǎo)劑具有廣闊的潛力,但單獨(dú)的化學(xué)藥物不能誘導(dǎo)足夠的ICD,而充分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 在臨床上往往需要高劑量的化療藥物,因其嚴(yán)重的毒副作用難以實現(xiàn)。藥物的組合可能因其機(jī)制協(xié)同,帶來誘導(dǎo)條件及結(jié)果的優(yōu)化。研究表明,放療與輕度熱療[7]、新型免疫調(diào)節(jié)劑IMMUNEPOTENT CRP 與奧沙利鉑[8]、吉西他濱與缺氧誘導(dǎo)因子-1 抑制劑PX-478[9]的組合等均可激發(fā)可觀的DAMPs 的釋放及腫瘤組織中更多的免疫細(xì)胞浸潤,對腫瘤生長具有顯著抑制作用。因此,聯(lián)合治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 的方法值得進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

米托蒽醌(mitoxantrone,MTX)是一種廣泛用于前列腺癌治療的抗腫瘤細(xì)胞毒性藥物[10],在黑色素瘤、骨肉瘤和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系中均可誘導(dǎo)ICD[11]。此外,MTX 通過前列腺癌細(xì)胞中p53 依賴蛋白激酶R 樣ER 激酶(P53-dependent protein kinase R-like ER kinase,PERK)的表達(dá)觸發(fā)ICD[12]。姜黃素(curcumin,Cur)是1815 年從姜黃根莖中提取的一種具有抗癌作用的多酚類物質(zhì),通過靶向不同的細(xì)胞信號通路,包括生長因子、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的基因等,顯示出抗癌能力[13]。Cur可通過抑制激活蛋白1(inhibitory activator protein 1,AP-1)和核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)因子在不同模型中發(fā)揮抗癌特性[14],如乳腺癌、肺癌、血液腫瘤和消化道腫瘤等[13]。也有研究表明,Cur 可通過激活miR-125a/ERRα 信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的死亡[15]。最值得一提的是,Cur 還可通過增加ROS 的生成和脂質(zhì)過氧化來施加氧化應(yīng)激,這在ICD 的發(fā)生發(fā)展過程中可起到一定的輔助作用。真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)的磷酸化對于CALR 的暴露至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn),Cur 能夠顯著誘導(dǎo)eIF2α 的磷酸化,進(jìn)而通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞凋亡,使前列腺癌細(xì)胞對化療藥物多西紫杉醇(docetaxel,DTX)致敏。Cur 還可通過激活caspase-1 和增加HMGB1 的釋放來誘導(dǎo)細(xì)胞的焦亡[16]。上述研究表明,Cur 具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 以及聯(lián)合其他化療藥物增強(qiáng)ICD 治療的潛力。

本研究在前期化療藥物初步篩選中,使用不同藥物處理小鼠宮頸癌TC-1 細(xì)胞,篩選出能有效誘導(dǎo)ICD 的藥物,并根據(jù)其藥物毒性動力學(xué)特征優(yōu)化誘導(dǎo)策略,為進(jìn)一步以其為模式,基于小鼠模型探討誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD 在腫瘤免疫治療中的潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 小鼠宮頸癌TC-1 細(xì)胞系是由HPV E6、E7 和ras 基因共轉(zhuǎn)染的C57BL/6 小鼠肺上皮細(xì)胞,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清、1% 100 U/mL 青霉素和0.1 mg/L 鏈霉素的RPMI1640 完全培養(yǎng)基,置37 ℃,5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2 ~ 3 d 傳代1 次。

1.2 實驗動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠,雌性,6 ~ 8周齡,體重16 ~ 18 g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所(IMBCAMS)中心動物護(hù)理服務(wù)中心,動物許可證編號:SYXK(滇)K2019-0003。所有動物實驗均經(jīng)IMBCAMS 動物護(hù)理和福利倫理委員會批準(zhǔn),所有的努力均是為了盡量減少動物痛苦。

1.3 主要試劑及儀器 HPV 16 型CTL 表位E749-57肽由上海吉爾生化有限公司合成;RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基購自以色列Biologicalindustrial 公司;胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司;基質(zhì)膠和70 μm 無菌細(xì)胞篩網(wǎng)購自美國BD Bioscience 公司;小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;Cell Activation Cocktail、Brefeldin A、Cell Staining Buffer、流式抗體、Fixation Buffer 和Permeabilization Wash Buffer 購自美國Biolegend 公司;Tween-20 購自中國Biosharp 公司;Collagenase A 購自瑞士Roche 公司;ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific 公司;MTX 和Cur 購自美國MCE 公司;小鼠抗β-actin 單克隆抗體購自美國Proteintech 公司;兔抗HMGB1 單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 購自英國Abcam 公司;HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG、ATP 檢測試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;多功能檢測酶標(biāo)儀購自美國Biotek 公司;轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀購自美國Biorad 公司;流式細(xì)胞儀購自美國Beckman 公司。

1.4 藥物處理對TC-1 細(xì)胞形態(tài)影響的檢測 將TC-1細(xì)胞以1 × 105個/ mL/孔的密度接種至12 孔板,置37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后,用2、10、20、35、50 μmol/L MTX 或20、50、80、100、120 μmol/L Cur 或3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理,以不進(jìn)行任何處理的細(xì)胞作為對照,繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞情況和形態(tài)變化。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 釋放的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)及處理同1.4 項。檢測前1 h,在細(xì)胞最大酶活性孔中加入10%培養(yǎng)基體積的LDH 釋放劑,收集上清,400 × g 離心5 min 后,取120 μL 加至96 孔板,再加入60 μL 監(jiān)測工作液(乳酸溶液、1 × INT 溶液及酶溶液按體積比1 ∶1 ∶1 充分混勻)反復(fù)抽吸混勻,避光反應(yīng)20 min。于490 nm 波長處檢測A 值,并按下式計算細(xì)胞死亡率。

1.團(tuán)長、副團(tuán)長:主要負(fù)責(zé)上下級溝通,統(tǒng)籌全團(tuán)總體事務(wù),把握項目方向和進(jìn)度,及時調(diào)整策略,解決帶有普遍性和全局性的問題,不兼任隊長、副隊長或組長。

1.6 MTX 與Cur 協(xié)同誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞發(fā)生ICD 的檢測

1.6.1 ATP檢測 將TC-1 細(xì)胞以每孔1×105個/mL的密度接種至12 孔板,37 ℃培養(yǎng)過夜后,進(jìn)行3 μmol/L MTX、50 μmol/L Cur 單獨(dú)或3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至4、6、8、12 和24 h 收集上清,4 ℃,12000 × g 離心5 min 后置于冰上。配置不同濃度(10、1、0.1、0.01 μmol/L及1 和0.1 nmol/L)的ATP 標(biāo)準(zhǔn)液,在96 孔板中加入100 μL 稀釋好的ATP 檢測工作液,避光室溫放置5 min;加入20 μL 樣品和標(biāo)準(zhǔn)液,反應(yīng)2 min;上化學(xué)發(fā)光儀測定熒光值,以ATP 濃度為橫坐標(biāo),熒光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后求得樣品中ATP含量。

1.6.2 HMGB1 檢測 將TC-1 細(xì)胞以每孔1×106個/2 mL 的密度接種至6 孔板,37 ℃培養(yǎng)過夜后,進(jìn)行3 μmol/L MTX、50 μmol/L Cur 單獨(dú)或3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至4、8、12、24、30 和36 h 收集上清,進(jìn)行Western blot分析:取相同體積的上清液,經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后,半干法轉(zhuǎn)移至孔徑為0.2 μm 的PVDF 膜上,加入50 mL 5%脫脂奶粉,室溫封閉2 h;分別加入兔抗HMGB1 單克隆抗體、小鼠抗β-actin 單克隆抗體(均1 ∶5000 稀釋),4 ℃孵育過夜;1 × TBST(1 L TBS + 500 μL 吐溫20)洗滌3 次,每次10 min,加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶3000 稀釋)及HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1 ∶8000 稀釋),室溫孵育2 h;1 × TBST 洗滌3 次,每次10 min,使用ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液(A 液∶B 液按體積比1 ∶1 充分混勻)顯色,用凝膠成像儀成像并拍照。試驗重復(fù)3 次。

1.7 動物免疫 TC-1 細(xì)胞生長至70% ~ 80%密度時,加入3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理,繼續(xù)置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;收集細(xì)胞,于C57BL /6J 小鼠左側(cè)皮下免疫1 × 106個細(xì)胞/ 100 μL(疫苗組),對照組注射同體積PBS。1 個月后右側(cè)皮下接種正常的TC-1 細(xì)胞1 × 105個/ 100 μL,進(jìn)行免疫挑戰(zhàn),期間密切監(jiān)測和記錄腫瘤生長情況。

1.8 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離 在實驗終點,斷頸處死小鼠,分離小鼠脾臟;在生物安全柜中,將70 μm 無菌細(xì)胞篩網(wǎng)置于50 mL 離心管中,脾臟置于細(xì)胞篩網(wǎng)中,分多次加入5 mL 小鼠淋巴細(xì)胞分離液,用5 mL 注射器活塞輕輕研磨,將研磨的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中,于液面上緩慢添加500 μL RPMI1640 培養(yǎng)基并保持液面分界明顯;室溫,800 × g 離心30 min,設(shè)置較低升速和降速,離心后可見細(xì)胞分層,吸出白色淋巴細(xì)胞層,加入10 mL RPMI1640 培養(yǎng)基重懸洗滌細(xì)胞,室溫,250 × g 離心10 min,棄上清,用RPMI1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.9 小鼠腫瘤淋巴細(xì)胞的分離 將小鼠腫瘤組織用滅菌剪刀剪碎,加入700 μL(1 mg/mL)Collagenase溶液(用RPMI1640 培養(yǎng)基溶解),37 ℃,120 r/min消化1 h;在生物安全柜中,將消化后的腫瘤組織置于細(xì)胞篩網(wǎng)中研磨,具體步驟參照1.8 項。

1.10 細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)水平的檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。分離各組小鼠脾臟和腫瘤淋巴細(xì)胞計數(shù)后,以1 × 107個/ mL 細(xì)胞濃度分別加至96 孔U 形細(xì)胞培養(yǎng)板中,100 μL/孔,加入合成的HPV CTL 表位E749-57 肽至終濃度為5 μg/mL,刺激總時間為7 h,在刺激2 h 后加入BrefeldinA;室溫,500 × g 離心5 min,吸出上清,用Cell Staining Buffer 洗滌細(xì)胞2 次,100 μL Cell Staining Buffer 重懸細(xì)胞,加入CD8α-APC 抗體,4 ℃避光孵育30 min;Cell Staining Buffer 洗滌2 次,200 μL預(yù)冷Fixation Buffer 重懸細(xì)胞,室溫避光孵育固定20 min;Cell Staining Buffer 洗滌3 次,加入200 μL Permeabilization Wash Buffer 重懸細(xì)胞,室溫,500 × g離心5 min,棄上清,重復(fù)2 次,用100 μL Permeabilization Wash Buffer 重懸細(xì)胞,加入IFNγ-PE 抗體,室溫避光孵育20 min;Permeabilization Wash Buffer 洗滌2 次,離心棄上清,用200 μL Cell Staining Buffer重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中后上機(jī)檢測。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPadPrism 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析及圖形繪制。組間比較采用非配對t 檢驗,以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量MTX 和Cur 對TC-1 細(xì)胞死亡的影響 不同劑量MTX 和Cur 處理TC-1 細(xì)胞24 h,顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,隨著MTX 和Cur 濃度的增加,細(xì)胞狀態(tài)越來越差,出現(xiàn)形態(tài)改變,死亡細(xì)胞數(shù)量也隨之增多。其中2 μmol/L MTX 和20 μmol/L Cur處理后即可引起細(xì)胞輕微程度死亡;50 μmol/L MTX 和120 μmol/L Cur 處理后出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞漂浮。見圖1 和圖2。上清LDH 釋放檢測結(jié)果顯示,MTX 和Cur 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的程度呈劑量依賴性(t = 1591982 ~ 345266064,P <0.0001;t =1224744838 ~ 14268811274,P <0.0001),見圖3。

圖1 不同劑量的MTX 對TC-1 細(xì)胞毒性的顯微鏡觀察(× 200)Fig.1 Microscopy of toxicity of MTX at various dosages to TC-1 cells(× 200)

圖2 不同劑量的Cur 對TC-1 細(xì)胞毒性的顯微鏡觀察(×200)Fig.2 Microscopy of toxicity of Cur at various dosages to TC-1 cells(× 200)

圖3 不同濃度的MTX(A)和Cur(B)對TC-1 細(xì)胞LDH釋放的影響Fig.3 Effects of various concentrations of MTX(A)and Cur(B)on LDH release from TC-1 cells

2.2 MTX 和Cur 處理不同時間對TC-1 細(xì)胞死亡的影響 顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,經(jīng)10 μmol/L MTX 和60 μmol/L Cur 處理后的TC-1 細(xì)胞隨時間延長,死亡形態(tài)越顯著,死亡率也逐漸增加。其中10 μmol/L MTX 處理24 h 和60 μmol/L Cur 處理6 h 即可觀察到細(xì)胞死亡狀態(tài)出現(xiàn)。見圖4 和圖5。上清LDH 釋放檢測結(jié)果也顯示,MTX 和Cur 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的程度呈時間依賴性(t = 879260525 ~3651753555,P <0.0001;t = 33768736 ~1685428676,P <0.0001),見圖6。

圖4 10 μmol/L MTX 處理不同時間后對TC-1 細(xì)胞毒性的顯微鏡觀察(× 200)Fig.4 Microscopy of toxicity of treatment with 10 μmol/L MTX for various hours to TC-1 cells(× 200)

圖5 60 μmol/L Cur 處理不同時間后對TC-1 細(xì)胞毒性的顯微鏡觀察(× 200)Fig.5 Microscopy of toxicity of treatment with 60 μmol/L Cur for various hours to TC-1 cells(× 200)

圖6 10 μmol/L MTX(A)和60 μmol/L Cur(B)處理不同時間對TC-1 細(xì)胞LDH 釋放的影響Fig.6 Effects of treatment with 10 μmol/L MTX(A)and 60 μmol/L Cur(B)on LDH release from TC-1 cells

2.3 MTX 與Cur 聯(lián)合對TC-1 細(xì)胞死亡的影響 顯微鏡下觀察顯示,MTX 與Cur 不同濃度聯(lián)合處理12 h后的TC-1 細(xì)胞與高濃度單獨(dú)處理呈現(xiàn)出相似的死亡情況,見圖7。3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur聯(lián)合處理24 h 后的TC-1 細(xì)胞,呈現(xiàn)出細(xì)胞變圓、死亡漂浮細(xì)胞少以及有明顯細(xì)胞形態(tài)改變等較為理想的死亡狀態(tài),見圖8。MTX 與Cur 聯(lián)合處理不同時間點,上清LDH 釋放量呈時間依賴性,并且比單獨(dú)用藥釋放了更多的LDH(t=700668866~8839039349;P <0.0001),見圖9。兩者聯(lián)合處理在降低了各自藥物使用劑量的同時也呈現(xiàn)出比高濃度單獨(dú)處理更好的細(xì)胞死亡狀態(tài),因此,接下來以此藥物聯(lián)合濃度配方探究其對TC-1 細(xì)胞特性的影響。

圖7 不同濃度的MTX 與Cur 聯(lián)合處理對TC-1 細(xì)胞毒性的顯微鏡觀察(× 200)Fig.7 Microscopy of toxicity of treatment with various concentrations of MTX combined with Cur to TC-1 cells(× 200)

圖8 MTX 與Cur 單獨(dú)或聯(lián)合處理對TC-1 細(xì)胞毒性的顯微鏡觀察(× 200)Fig.8 Microscopy of toxicity of treatment with MTX and Cur alone or in combination to TC-1 cells(× 200)

圖9 3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理對TC-1 細(xì)胞的毒性Fig.9 Toxicity of treatment with 3 μmol/L MTX combined with 50 μmol/L Cur to TC-1 cells

2.4 MTX 與Cur 協(xié)同處理對TC-1 細(xì)胞發(fā)生ICD的影響 3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理TC-1 細(xì)胞不同時間后,隨著處理時間的延長,細(xì)胞上清中釋放了比單獨(dú)處理更多的ATP(t =4092041436 ~ 13672247592;P <0.0001),見圖10。3 μmol/L MTX 與50 μmol/L Cur 聯(lián)合處理后細(xì)胞上清中釋放的HMGB1 也較單獨(dú)處理明顯增多,且呈現(xiàn)時間依賴性,見圖11。表明MTX 與Cur 能夠協(xié)同誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞發(fā)生ICD,引起較為理想的免疫原性介質(zhì)釋放。

圖10 MTX 與Cur 聯(lián)合處理對細(xì)胞上清中ATP 釋放的影響Fig.10 Effect of treatment with MTX combined with Cur on ATP release in cell supernatant

圖11 MTX 與Cur 聯(lián)合處理對細(xì)胞上清中HMGB1 釋放的影響Fig.11 Effect of treatment with MTX combined with Cur on HMGB1 release in cell supernatant

2.5 MTX 與Cur 聯(lián)合處理的TC-1 細(xì)胞作為腫瘤疫苗的潛力 體內(nèi)動物實驗結(jié)果顯示,疫苗組小鼠腫瘤得到一定程度控制(t = 2.792,P <0.05);至實驗終點,分離死亡小鼠腫瘤和脾臟稱重,疫苗組小鼠腫瘤和脾臟重量均低于對照組(t 分為2.864 和3.035;P 均<0.05);兩組小鼠體重在監(jiān)測期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t = 0.7217;P >0.05)。見圖12。證明了疫苗的安全性。

圖12 MTX 與Cur 聯(lián)合處理對C57BL/J 小鼠腫瘤生長的抑制作用Fig.12 Inhibitory effect of treatment with MTX combined with Cur on tumor growth in C57BL/J mice

2.6 MTX 與Cur 聯(lián)合處理的TC-1 細(xì)胞免疫小鼠脾臟、腫瘤組織中分泌IFNγ 的CTL 水平和MDSC水平 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,與對照組相比,疫苗組小鼠脾臟和腫瘤組織中分泌IFNγ 的CTL 水平升高(t 分別為8.692 和5.891;P 均<0.01)。與對照組相比,疫苗組小鼠脾臟和腫瘤組織中的MDSC數(shù)量被抑制(t 分別為5.745 和9.338;P 均<0.01)。見圖13。這與2.5 項腫瘤大小結(jié)果一致。

圖13 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟和腫瘤中分泌IFNγ 的CTL 水平和MDSC 水平Fig.13 Flow cytometry of IFNγ-secreting CTL and MDSC levels in spleen and tumor of mice

3 討論

目前惡性腫瘤的治療主要依賴于手術(shù)、放療和化療,而有效新藥的尋找以及藥物的毒副作用仍然是臨床面臨的挑戰(zhàn)。免疫療法在某種程度上似乎為癌癥患者帶來了全新的希望,如嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)、PD-1/PD-L1[17]和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4,CTLA-4)免疫檢查點療法等新手段在臨床上展現(xiàn)出較好的療效。雖然已在多種腫瘤如黑色素瘤,非小細(xì)胞肺癌、腎癌和前列腺癌等實體瘤的治療中展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性,且多個腫瘤免疫治療藥物已經(jīng)獲得美國FDA 批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用。但此類藥物僅對部分腫瘤有一定療效,臨床上仍有大量患者無法獲益。近年來發(fā)現(xiàn)化療藥物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD,從而激發(fā)理想的抗腫瘤免疫。如何能高效安全地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 并實現(xiàn)腫瘤的免疫治療應(yīng)用成為研究的新熱點。摸索出低毒高效性且適用于誘導(dǎo)廣譜腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD 的最優(yōu)配方對有效利用ICD 以達(dá)到理想的廣譜和個性化治療均具有重要意義,從而為癌癥的臨床治療提供新的思路和方法。

MTX 為合成的含氨基的蒽環(huán)類藥物,是細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥,通過與DNA 分子結(jié)合抑制核酸合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前已被證實可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD,且作為疫苗在動物模型中也能激發(fā)有效的腫瘤免疫效應(yīng)[18]。Cur 作為最有前景的一類生物活性天然化合物,在癌癥治療方面具有獨(dú)特的潛力,其可促使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的特點或許可在ICD 的發(fā)生發(fā)展中扮演一個理想的輔助角色。目前Cur 與其他藥物聯(lián)合抗腫瘤的研究逐漸被關(guān)注,與抗EGFR 單克隆抗體聯(lián)合治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌被認(rèn)為是一種非常有效的疾病控制策略[19]。本研究利用MTX 與Cur 分別或聯(lián)合對宮頸癌相關(guān)細(xì)胞TC-1 進(jìn)行了體外處理,對聯(lián)合處理后的細(xì)胞形態(tài)、免疫介質(zhì)和ICD 分子進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)兩者均能有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,且聯(lián)合后效果更佳。此外,經(jīng)過聯(lián)合處理的TC-1 細(xì)胞作為疫苗可在一定程度上抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長。腫瘤特異性效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生和在腫瘤組織中積累及其功能對于腫瘤細(xì)胞的清除起到至關(guān)重要的作用。當(dāng)腫瘤已建立,免疫抑制細(xì)胞MDSC 成熟由脾臟遷移至腫瘤組織促使腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成,阻礙腫瘤特異性CTL 的殺腫瘤效應(yīng)并介導(dǎo)免疫逃逸。本研究證明,經(jīng)過聯(lián)合處理的TC-1 細(xì)胞作為疫苗可在提高脾臟和腫瘤中CTL 水平的同時也降低MDSC 的數(shù)量,這對抗腫瘤免疫來說至關(guān)重要。

目前臨床上使用的藥物中可誘導(dǎo)ICD 的不多,且往往能誘導(dǎo)ICD 產(chǎn)生的藥物劑量已經(jīng)對癌癥患者造成了嚴(yán)重的毒副作用,因此,高效低劑量的誘導(dǎo)物配方值得進(jìn)一步探索。本研究發(fā)現(xiàn),MTX 與Cur 聯(lián)合后能在各自較低濃度時帶來誘導(dǎo)結(jié)果的理想化,這在臨床藥物的使用和研究上有一定的指導(dǎo)作用。此外,還可通過將MTX 與Cur 共同整合至納米腫瘤靶向遞送材料中,實現(xiàn)體內(nèi)直接ICD 的誘導(dǎo)。在ICD誘導(dǎo)物的探索中,存在誘導(dǎo)后細(xì)胞狀態(tài)以及關(guān)鍵條件把控的問題。我們希望誘導(dǎo)ICD 的發(fā)生呈現(xiàn)一種緩慢持續(xù)的過程,細(xì)胞在該過程中持續(xù)不斷地釋放腫瘤抗原和DAMPs,并在誘導(dǎo)物撤除的情況下也能在繼續(xù)死亡過程的同時依舊釋放相關(guān)免疫介質(zhì),并最終走向死亡。誘導(dǎo)至“將死”狀態(tài)的細(xì)胞才能作為ICD 腫瘤疫苗,因此對誘導(dǎo)物、誘導(dǎo)時間以及細(xì)胞狀態(tài)的把控需要更精細(xì)地探索。

綜上所述,本研究初步確立了Cur 協(xié)同MTX 誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞發(fā)生ICD 的優(yōu)化條件,考察了其基本特征并在動物實驗中進(jìn)行了證實,為相關(guān)研究的進(jìn)一步開展以及臨床用藥奠定了基礎(chǔ)。

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