明珠，張西臣，趙春艷，張楠，程淑琴，王曉岑，李新，李建華，宮鵬濤，張媛媛

1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.吉林大學人獸共患病研究所，吉林 長春 130062

十二指腸賈第鞭毛蟲（Giardia duodenalis）簡稱賈第蟲，是一種機會致病性人獸共患寄生蟲，廣泛寄生于人和哺乳動物，能引起以腹瀉為主要癥狀的腸道疾?。?］，感染率高，嚴重危害人類健康［2］。賈第蟲滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)簡單，無線粒體和高爾基體結(jié)構(gòu)，含有兩個形態(tài)大小和DNA 含量幾乎相同的細胞核［3-4］，與其他真核生物不同的是，不含有核仁，并具有一部分原核生物特征。因此，賈第蟲被認為是原核生物和真核生物的過渡階段，是一種理想的“模式生物”［5］。賈第蟲滋養(yǎng)體以二分裂方式增殖，能夠進行體外純培養(yǎng)及反復傳代，呈“永生化”現(xiàn)象。研究顯示，細胞的永生化與端粒-端粒酶（telomerase）調(diào)控有關(guān)［6］，因此，研究賈第蟲端粒及端粒酶的生物學特性十分必要，可為進一步探索其他真核生物端粒酶調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

端粒酶是一種核糖核酸-蛋白質(zhì)復合物，能夠維持染色體端粒的長度及穩(wěn)定，其活性與細胞的死亡、凋亡、癌變、分裂以及衰老等活動密切相關(guān)［7］。其由具有催化活性的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和端粒酶RNA（telomerase RNA，TER）以及TER 結(jié)合蛋白（TER-binding protein，RNP）組成，其中TERT 包含一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNA 結(jié)合域（TERT RNA-binding domain，TRBD），主要參與核糖體蛋白復合物的組裝，對端粒酶活性至關(guān)重要［8］。端粒酶活性調(diào)節(jié)受諸多因素的影響，其中端粒酶相關(guān)蛋白作為端粒酶的輔助因子，直接或間接參與端粒酶與端粒的調(diào)節(jié)，對端粒及端粒酶調(diào)控具有重要作用。目前已報道賈第蟲RFC1 等端粒酶相關(guān)蛋白［9］，但賈第蟲端粒酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)很復雜，目前對端粒酶相關(guān)蛋白了解較少。因此，本研究旨在通過構(gòu)建賈第蟲BK-TRBD誘餌質(zhì)粒，繼續(xù)篩選新的端粒酶相關(guān)蛋白，為進一步研究賈第蟲端粒及端粒酶調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、細胞株及質(zhì)粒 十二指腸賈第蟲WB蟲株、賈第蟲酵母雙雜交cDNA 質(zhì)粒文庫、Y2H Gold酵母株、HEK293T 細胞、酵母雙雜交相關(guān)質(zhì)粒pGADT7-Lam、pGBKT7-P53、pGADT7-T 和pGBKT7、原核表達載體pET-32a 和pGEX-4T-1、雙分子熒光互補載體pBiFC-bJun 和pBiFC-bFos 均由吉林大學動物醫(yī)學學院寄生蟲課題組保存；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購自北京康為世紀生物有限公司。

1.2 主要試劑 rTaq 酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；-Trp／-His／-Leu／-Ade DO Supplement、LLeucinne、L-Tryptophan、L-Histidine、X-α-Gal、酵母質(zhì)粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Ni-Agarose 和GST Resin 購自北京康為世紀生物有限公司；His-tag 標簽抗體和HRP 標記的山羊抗鼠IgG 購自美國Proteintech 公司。

1.3 賈第蟲的培養(yǎng) 從液氮中取出賈第蟲WB 蟲株，置于37 ℃水浴快速融解。將賈第蟲滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)接至含改良的TYI-S-33 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 ～48 h 至對數(shù)生長期，觀察蟲體生長狀態(tài)。若蟲體生長狀態(tài)良好，呈貼壁狀態(tài)，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.4 賈第蟲cDNA 的獲得 將生長狀態(tài)良好的賈第蟲滋養(yǎng)體進行純化，采用Trizol 法提取賈第蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得賈第蟲cDNA，于-40 ℃保存。

1.5 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank 中登錄的賈第蟲端粒酶RNA 結(jié)合域TRBD 基因序列（Gen-Bank：AF195121.1），運用Oligo7、SnapGene 軟件設(shè)計特異性引物，上游引物序列：5′-CATATGGACAAGAAACCCCAATCTCT-3′（斜體部分為NdeⅠ酶切位點），下游引物序列：5′-GGATCCATAGACAAACGATAGCCTACCG-3′（斜體部分為BamHⅠ酶切位點）。引物由庫美生物有限公司合成。以賈第蟲cDNA 為模板，PCR 擴增TRBD 基因序列，反應(yīng)條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ對膠回收產(chǎn)物和pGBKT7 載體進行雙酶切，并用T4 DNA 連接酶相連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，涂布于含卡那霉素的固體LB 培養(yǎng)板上。挑取單克隆菌落并擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pGBKT7-TRBD，用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，并送庫美生物有限公司測序。

1.6 誘餌蛋白毒性及自激活作用檢測

1.6.1 毒性作用檢測 將pGBKT7-TRBD 和pGBKT7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母菌，菌液涂布至SD／-Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 ～5 d，觀察菌落形態(tài)。若兩組菌落形態(tài)和數(shù)量無明顯變化，則表明誘餌蛋白無毒性作用。

1.6.2 自激活作用檢測 將pGBKT7-TRBD、陽性對照pGBKT7-P53／pGADT-7 和陰性對照pGBKT7-Lam／pGADT-7 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母菌，菌液涂布于SD／-Trp／-Leu 營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d；分別挑取3 組單克隆菌落，點種于SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade／X-α-Gal，30 ℃倒置培養(yǎng)2 ～3 d，觀察菌落顏色變化。若試驗組菌落不顯色，則表明誘餌基因無自激活作用。

1.7 TRBD 互作蛋白的篩選及回返驗證 采用PEG／LiAc 轉(zhuǎn)化法將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRBD 和賈第蟲酵母雙雜交cDNA 質(zhì)粒文庫共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母菌，涂布于SD／-Trp／-Leu／-His 培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d；分別挑取單克隆菌落，點種于SD ／-Trp／-Leu／-His／-Ade／X-α-Gal，30 ℃倒置培養(yǎng)2 ～3 d，若試驗組菌落顯藍色，則初步判斷為陽性菌落。為了降低假陽性結(jié)果，對篩選出的基因X 進行回返驗證，若試驗組菌落生長且顯藍色，對照組不顯藍色，則進一步驗證pGBKT7-TRBD 與篩選出的文庫質(zhì)粒的互作關(guān)系。

1.8 雙分子熒光互補驗證 根據(jù)GenBank 中TRBD與篩選出的X 基因序列，設(shè)計特異性引物序列：pbFos-TRBD-F：5′-GCTAGCCACCATGGACAAGAAACCCCAATCTCT-3′（斜體部分為NheⅠ酶切位點），pbFos-TRBD-R：5′-GGTACCATAGACAAACGATAGCCTACCG-3′（斜體部分為KpnⅠ酶切位點）；pbJun-X-F：5′-GCTAGCCACCATGGTTATGCCCGCTGAAGTCTTCGAGT-3′（斜體部分為NheⅠ酶切位點），pbJun-X-R：5′-CTCGAGCTAAGAATTTTCGTGAGAAGGAC-3′（斜體部分為XhoⅠ酶切位點）。以賈第蟲cDNA 為模板進行PCR 擴增，pbFos-TRBD 反應(yīng)條件為：93 ℃3 min；93 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃50 s，共34 個循環(huán)；再延伸5 min。pbJun-X 反應(yīng)條件為：93 ℃3 min；93 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃90 s，共34個循環(huán)；再延伸5 min。將TRBD 與X 基因分別連接至雙分子熒光互補載體pBiFC-bFos 和pBiFC-bJun上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pbFos-TRBD 和pbJun-X，并送至庫美生物有限公司測序。提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，通過Lipofectamine 2000 將二者共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞，24 ～ 36 h 后染色制片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。若二者在HEK293T 細胞內(nèi)能夠發(fā)生蛋白互作，則呈紅色熒光。

1.9 GST-Pull down 驗證 參考1.5 項步驟構(gòu)建pET-32a-TRBD 和pGEX-4T-1-X 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母菌中，分別取10 μL 菌液接種于含氨芐青霉素（終濃度為100 μg／mL）的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，140 r／min 培養(yǎng)1 ～ 2 h，至產(chǎn)生云霧狀現(xiàn)象為止；向菌液中加入1／1000 的IPTG（24 mg／mL），37 ℃，140 r／min 誘導培養(yǎng)6 h。將誘導后的菌體超聲破碎，收集蛋白粗提取物，分別通過Ni-Agarose 和GST Resin 填料層析柱分離純化His 標簽融合蛋白和GST 標簽融合蛋白。將GST 瓊脂糖凝膠分別與純化后的pGEX-4T-1-X 和pGEX-4T-1 蛋白于4 ℃共孵育4 h 后，離心棄上清，分別加入純化后的32a-TRBD重組蛋白，4 ℃搖床孵育4 h 后進行Western blot 分析：蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入His-tag 標簽抗體（1 ∶2000稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌5 次，加入HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1 ∶5000 稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗滌5 次，顯色。

2 結(jié)果

2.1 誘餌質(zhì)粒的鑒定 TRBD 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見657 bp 的特異條帶，大小與預期一致，見圖1。重組質(zhì)粒pGBKT7-TRBD 經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，可見大于4000 bp 的載體條帶和657 bp 的目的基因條帶，大小均與預期一致，見圖2。測序結(jié)果經(jīng)比對，與TRBD 基因序列一致，表明重組質(zhì)粒pGBKT7-TRBD 構(gòu)建正確。

圖1 TRBD 基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of TRBD gene

圖2 重組質(zhì)粒pGBKT7-TRBD 的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pGBKT7-TRBD

2.2 誘餌蛋白毒性及自激活作用

2.2.1 毒性作用 pGBKT7-TRBD 與pGBKT7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液在SD／-Trp 培養(yǎng)板上的菌落形態(tài)、大小無明顯差異，見圖3。表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRBD 對酵母細胞無毒性作用。

圖3 誘餌蛋白的毒性作用檢測Fig.3 Toxicity test of bait protein

2.2.2 自激活作用 試驗結(jié)果顯示，誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRBD 不顯色，見圖4。表明誘餌基因?qū)湍讣毎麩o自激活反應(yīng)。

圖4 誘餌基因的自激活作用檢測Fig.4 Determination of self-activation of bait gene

2.3 TRBD 互作蛋白的篩選 在SD／-Trp／-Leu ／-His 營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，陽性對照組pGBKT7-P53／pGADT-7 能穩(wěn)定生長，陰性對照組不生長，見圖5。挑取單克隆菌落點種于SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade培養(yǎng)基中，有部分菌落不生長，表明該菌落為假陽性結(jié)果，見圖6。挑取四缺培養(yǎng)板中單克隆菌落點種于顯色板中，在α-半乳糖苷酶作用下，菌落顯藍色，初步判斷為陽性菌落，見圖7。

圖5 酵母雙雜交試驗Fig.5 Yeast two-hybrid test

圖6 陽性菌落的篩選Fig.6 Screening of positive colonies

圖7 α-半乳糖苷酶顯色試驗Fig.7 Color development of X-α-Gal

2.4 陽性克隆回返驗證 經(jīng)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選初步得到5 個陽性基因，見表1?；胤凋炞C結(jié)果顯示，試驗組和陽性對照組菌落呈藍色，陰性對照與空載體組不顯色，見圖8。表明Heat shock protein 90（Hsp90）與TRBD 存在相互作用關(guān)系。

表1 酵母雙雜交篩選結(jié)果Tab.1 Screening results of yeast two-hybrid system

圖8 回返驗證Fig.8 Return verification

2.5 雙分子熒光互補驗證

2.5.1 重組質(zhì)粒pbJun-Hsp90 和pbFos-TRBD 的鑒定 Hsp90 和TRBD 基因的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見1039 和657 bp 的特異性條帶，見圖9 和圖10。重組質(zhì)粒pbJun-Hsp90 和pbFos-TRBD 分別經(jīng)NheⅠ／ XhoⅠ和NheⅠ／ PvuⅠ雙酶切驗證，均可見相應(yīng)的目的基因條帶和大于5000 bp 的載體條帶，見圖11 和圖12，且測序結(jié)果與目的基因序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖9 Hsp90 基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.9 Electrophoretic profile of PCR product of Hsp90 gene

圖10 TRBD 基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.10 Electrophoretic profile of PCR product of TRBD gene

圖11 重組質(zhì)粒pbJun-Hsp90 的雙酶切鑒定Fig.11 Restriction map of recombinant plasmid pbJun-Hsp90

圖12 重組質(zhì)粒pbFos-TRBD 的雙酶切鑒定Fig.12 Restriction map of recombinant plasmid pbFos-TRBD

2.5.2 雙分子熒光互補試驗 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，共轉(zhuǎn)染組與陽性對照組顯紅色熒光，陰性對照組不發(fā)光，見圖13。表明Hsp90 與TRBD 存在相互作用。

圖13 雙分子熒光互補試驗驗證TRBD 與Hsp90 的相互作用Fig.13 Verification for interaction between TRBD and Hsp90 by bimolecular fluorescence complementation test

2.6 GST-Pull down 驗證

2.6.1 TRBD 和Hsp90 蛋白的表達及純化 12%SDS-PAGE 分析顯示，純化后得到相對分子質(zhì)量約38000 和72000 的32a-TRBD 和Hsp90 重組蛋白，見圖14 和圖15。

圖14 純化重組蛋白32a-TRBD 的SDS-PAGE 分析Fig.14 SDS-PAGE profile of purified recombinant protein 32a-TRBD

圖15 純化重組蛋白Hsp90 的SDS-PAGE 分析Fig.15 Purification of recombinant protein Hsp90 by SDSPAGE

2.6.2 GST-Pull down 試驗 Western blot 分析顯示，32a-TRBD 和Hsp90 共孵育組可檢測到含有His標簽的32a-TRBD 融合蛋白，對照組pGEX-4T-1 和32a-TRBD 共孵育組未檢測到32a-TRBD 融合蛋白，見圖16。表明TRBD 與Hsp90 存在相互作用。

圖16 GST-Pull down 驗證TRBD 與Hsp90 的互作Fig.16 Verification for interaction between TRBD and Hsp90 by GST-Pull down test

3 討論

端粒酶的調(diào)控機制是復雜且多層次的，其過程包括端粒酶各組分的合成、轉(zhuǎn)錄、翻譯修飾以及亞細胞定位，還包括端粒酶裝配及運輸乃至向端粒末端募集的調(diào)控［10］。在許多細胞中發(fā)現(xiàn)，端粒酶的活性主要受TERT 基因的表達調(diào)控，而端粒酶活性調(diào)節(jié)及蛋白組裝需要多種特異性蛋白質(zhì)參與，這些蛋白質(zhì)能瞬時或組成性地與端粒酶結(jié)合，從而促進活性端粒酶復合物的形成［8］。目前已報道Sp1、c-Myc、PES1、LARP7、POT1-TPP1 等多種端粒酶活性調(diào)節(jié)蛋白［11-14］。有研究表明，TERT 的轉(zhuǎn)錄水平受Sp1、c-Myc、β-聯(lián)合蛋白等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，Sp1 結(jié)合位點的突變能夠?qū)е耇ERT 表達的顯著降低，同時，TERT 也可直接與這些轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，以輔助激活子的形式調(diào)節(jié)Wnt／β-catenin、NF-κB 等多種信號通路下游基因的表達，在腫瘤形成、細胞增殖及免疫調(diào)節(jié)等進程中發(fā)揮重要作用［15-16］。在細胞周期調(diào)控進程中，端粒酶復合體的裝配需要snoRNA 結(jié)合蛋白、GAR1、TCAB1 等蛋白的共同參與，從而進一步調(diào)控端粒酶運輸［15］。但迄今端粒酶的調(diào)控機制仍需更多探索。

在寄生蟲領(lǐng)域中，對寄生蟲端粒酶的相關(guān)研究較少，目前已報道14-3-3 蛋白對柔嫩艾美爾球蟲端粒酶活性具有負調(diào)節(jié)作用，而OUT 泛素化蛋白可能正向調(diào)控端粒酶活性［17］；賈第蟲端粒酶TRBD 與復制因子RFC1 和鋅指蛋白ZFD 均能正向調(diào)控端粒酶活性，進而影響蟲體的生長增殖［9，18］，但其在端粒酶調(diào)控中的作用尚不清楚。端粒酶調(diào)控是一個復雜的過程，可能需要多種蛋白因子互作調(diào)控，因此，需篩選獲得更多參與端粒酶調(diào)控的互作蛋白。而賈第蟲作為一種理想的真核模式生物，明確其端粒酶及端粒相關(guān)蛋白的調(diào)控關(guān)系，對高等生物端粒酶機制研究具有借鑒作用。因此，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)成功篩選出新的端粒酶相關(guān)蛋白，即Hsp90（GenBank：XM_001707939.2）。Hsp90 是一種高度保守的伴侶蛋白，在哺乳動物中可參與蛋白質(zhì)折疊，維持細胞穩(wěn)態(tài)，能夠與眾多伴侶蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)關(guān)鍵的生理過程，如細胞增殖、細胞周期調(diào)控、激素信號傳導和細胞凋亡等［19-20］。在人類端粒酶相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，Hsp90 和p23 能與hTERT 特異性結(jié)合，并影響其與模板RNA 的正確組裝［21］。目前，在弓形蟲中發(fā)現(xiàn)Hsp90 可能參與蟲體入侵復制及速殖子-緩殖子相互轉(zhuǎn)化等過程［22］。KAMIKAWA 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90 在賈第蟲中能夠參與蛋白質(zhì)折疊，而Hsp90 mRNA 的成熟需要賈第蟲中特殊剪接體介導的反式剪接。本研究篩選出端粒酶相關(guān)蛋白Hsp90，為進一步探索賈第蟲端粒及端粒酶調(diào)節(jié)機制奠定了基礎(chǔ)，同時也為賈第蟲的生物學特性研究提供了新的思路。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法有很多，如免疫層析技術(shù)、免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)、酵母雙雜交、雙分子熒光互補技術(shù)等［24］。其中，酵母雙雜交技術(shù)是較常用的一種分子技術(shù)，試驗操作簡單，成本低，適用性廣泛。其原理是利用酵母細胞的Gal4 系統(tǒng)含有兩個功能結(jié)構(gòu)域，即DNA 特異結(jié)合域（DNAbinding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription activation domain，AD），這兩個結(jié)構(gòu)域彼此分割，互不影響，但只有在兩個結(jié)構(gòu)域同時存在時才能激活下游基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄［25］。本研究通過構(gòu)建pGBKT7-TRBD 誘餌質(zhì)粒，利用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選得到5 個陽性克隆，但由于某些融合基因表達蛋白無需特異性結(jié)合即能激活轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或某些蛋白與其他蛋白的低親和力區(qū)易結(jié)合形成蛋白復合物而引起報告基因表達，會出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果［26］。因此，需通過回返驗證進一步驗證是否存在蛋白互作現(xiàn)象，以此降低假陽性結(jié)果。此外，在不同組織細胞中，蛋白質(zhì)之間的相互作用可能會發(fā)生改變，不能只通過一種方法判斷。因此，本研究利用雙分子熒光互補技術(shù)和GST-Pull down 技術(shù)進一步驗證了TRBD與Hsp90 在細胞內(nèi)和體外均存在互作關(guān)系，為探索賈第蟲端粒酶調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。