賈偉娟，張佳奇，張玲艷，何云江，郗珊珊，王學(xué)理

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130033

牛猝死癥是一種引起牛發(fā)生猝死的綜合征，在不同國家和地區(qū)均有發(fā)生［1］。該病的病因較多且大多具有傳染性，主要分為細菌性、病毒性、中毒性及營養(yǎng)代謝性［2］。其中，細菌感染引發(fā)的猝死癥較為多見，主要病原菌有魏氏梭菌、腐敗梭菌、多殺性巴氏桿菌及一些鏈球菌等［3］。

金黃色葡萄球菌為兼性厭氧的革蘭陽性致病菌，是葡萄球菌中毒力最強的菌株［4］。該菌與人和動物的化膿性及毒素介導(dǎo)的感染有關(guān)，這些感染均由其產(chǎn)生的毒力因子所導(dǎo)致，可使其入侵機體并逃避機體免疫效應(yīng)對宿主造成影響。凝固酶是最早發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌毒力因子之一，已廣泛用于區(qū)分金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌［5］；該菌的其他毒素還可引起化膿性感染、菌血癥、乳房炎及關(guān)節(jié)炎等人和動物多種疾病，嚴重的可導(dǎo)致猝死［6］。畜牧業(yè)是內(nèi)蒙古自治區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)，牛群的健康直接影響本地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展。為了解通遼市某西門塔爾牛養(yǎng)殖場多頭牛猝死的原因，本研究從病死牛的病變組織中分離菌株，并進行鑒定，以期為本地區(qū)牛猝死癥的流行病學(xué)調(diào)查及綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病畜 猝死牛由通遼市某西門塔爾牛養(yǎng)殖場提供。

1.2 菌株 表皮葡萄球菌［CMCC（B）26069］和金黃色葡萄球菌（CMCC26003）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 主要試劑及儀器 Baird-Parker 瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司；氯化鈉及葡萄糖購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂及蛋白胨購自上海博微生物科技有限公司；酵母浸粉購自瑞楚生物科技（江蘇）有限公司；DL2000 DNA marker、2 × PCRMatermix、細菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片購自賽諾利康生物技術(shù)（北京）有限公司；凍干兔血漿購自青島海博生物科技有限公司；AST 肉湯培養(yǎng)基及BD PhoenixTM100 全自動微生物分析系統(tǒng)購自美國BD 醫(yī)療器械有限公司。

1.4 實驗動物 SPF 級BALB／c 小鼠，15 只，28 日齡，體重25 ～ 30 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物合格證號為：2018-0001。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進行。

1.5 細菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察 采用無菌操作從病死牛的心、肝、脾、肺、腎等病變臟器組織中取樣，用接種環(huán)劃線，接種至LB 固體培養(yǎng)板，于37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，經(jīng)革蘭染色、鏡檢，再經(jīng)純培養(yǎng)，獲得分離菌株，進行后續(xù)檢測。

1.6 分離菌株的Baird-Parker 氏培養(yǎng)板培養(yǎng) 挑取分離菌菌落，于Baird-Parkershi 氏培養(yǎng)板上劃線，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，觀察菌落生長特征。

1.7 分離菌株的血漿凝固酶試驗 參考文獻［7］進行血漿凝固酶試驗。將1 mL 稀釋血漿（用生理鹽水按1 ∶100 比例稀釋）加入試管，再分別加入0.6 mL 的分離菌液、標準陰性菌株菌液（表皮葡萄球菌）和標準陽性菌株菌液（金黃色葡萄球菌），置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)；每30 min 觀察1 次，若血漿不發(fā)生凝集，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果。為避免出現(xiàn)假陽性，可將觀察時間延長至24 h［8］。

1.8 分離菌株的生化鑒定 將分離菌濃度調(diào)至0.6個麥氏單位時，取25 μL，接種至AST 肉湯培養(yǎng)基，混勻，加至檢測板內(nèi)，置BD PhoenixTM100 全自動微生物分析系統(tǒng)中24 h，檢測結(jié)果。

1.9 分離菌株的藥敏檢測 取100 μL 分離菌菌液，接種至LB 固體培養(yǎng)板上，涂布均勻。將11 種藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)板上，于37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.10 分離菌株的16S rRNA 同源性分析 參考文獻［9］合成細菌16S rRNA 基因擴增引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，擴增片段大小為1496 bp［9］。用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌DNA，以其為模板進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系為：2×Det PCR MasterMix 10.0 μL，模板1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 補充至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DNA 凝膠回收試劑盒純化，送至深圳華大基因股份有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站通過BLAST 進行序列對比分析，選取分離于不同地區(qū)的具有代表性的金黃色葡萄球菌菌株序列，應(yīng)用DNAstar 7.1 軟件編輯所選取的序列，構(gòu)建遺傳進化樹并對比核苷酸同源性。

1.11 分離菌株的動物致病性試驗 將15 只小鼠隨機分為3 組：低劑量組（106CUF／mL 分離菌）、高劑量組（108CUF／mL 分離菌）及對照組（0.9%氯化鈉溶液），均經(jīng)腹腔注射，0.5 mL／只，注射后每隔30 min觀察1 次，連續(xù)觀察72 h，記錄小鼠發(fā)病情況。

1.12 動物臟器病理組織觀察 將無菌取出的心、肝、脾、肺、腎組織塊置10%固定液中浸泡3 d；依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋；次日，切片經(jīng)HE 染色，置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài) 分離菌株在LB 固體培養(yǎng)基上有多個表面隆起的白色菌落生長，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后轉(zhuǎn)為金黃色，均為革蘭陽性球菌，且多呈葡萄串狀排列。見圖1。

圖1 分離菌形態(tài)的鏡下觀察（× 1000）Fig.1 Microscopy of morphology of isolates（× 1000）

2.2 分離菌株在Baird-Parker 氏培養(yǎng)板上的菌落特性分離菌株于Baird-Parker 氏培養(yǎng)板上可見黑色菌落。且菌落周圍伴有狹小渾濁帶及較寬透明圈，見圖2。

圖2 分離菌株于Baird-Parker 氏培養(yǎng)板上的生長形態(tài)Fig.2 Colony growth morphology of isolates on Baird-Parker medium

2.3 分離菌株的血漿凝固酶試驗結(jié)果 2、3 號試管內(nèi)血漿完全凝固，1 號試管未出現(xiàn)血漿凝固現(xiàn)象，見圖3。表明該分離菌株可凝固添加抗凝劑的血漿。

圖3 血漿凝固試驗結(jié)果Fig.3 Plasma coagulation test

2.4 分離菌株的生化鑒定結(jié)果 分離菌株的3-甲基戊二酸、黏菌素、D-葡萄糖酸、D-果糖、4 甲基傘型酮-磷酸、對硝基苯-AD-葡萄糖苷、右旋糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-甘露糖、亞氨基二乙酸、α-酮戊二酸、3-甲基己二酸、麥芽糖、尿素、胸腺嘧啶脫氧核苷試驗均為陽性，表明分離菌株能分解海藻糖、麥芽糖和尿素等；分離菌株的精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-組氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-異亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-焦谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、α-甲基葡萄糖苷、七葉苷、4 甲基傘型酮-BD-纖維素二糖甙、4 甲基傘型酮-BD-葡萄糖苷、4 甲基傘型酮-N-乙酰-BD-氨基葡糖苷、丙氨酸-丙氨酸-對硝基苯胺、L-脯氨酸-對硝基苯胺、對硝基苯-磷酸、β-龍膽二糖、D-塔格糖、麥芽三糖、N-乙酰-葡萄糖胺試驗為陰性，表明分離菌株不能分解塔格糖、七葉苷、甲基葡萄糖苷等。符合金黃色葡萄球菌的生化特性。

2.5 分離菌株的藥敏檢測結(jié)果 分離菌株對諾氟沙星、呋喃唑酮、克林霉素等藥物敏感，對青霉素耐藥，見表1。

表1 分離菌藥物敏感性試驗結(jié)果Tab.1 Drug sensitivity test of isolates

2.6 分離菌株的16S rRNA 同源性分析 16S rRNA基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1496 bp 的目的基因條帶，大小與預(yù)期一致，見圖4。測序結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物序列與金黃色葡萄球菌16S rRNA 片段一致。因此，確定分離菌為金黃色葡萄球菌，并命名為TL。進化樹分析結(jié)果表明，TL 與大連分離株KF495200、陜西分離株MK809243 及伊朗分離株KF254639 核苷酸序列同源性較高，分別為99.3%、99.1%、99.2%；與朝鮮分離株HM181992、北京分離株KT003251、山東分離株MF805761、江西分離株MK88615、印度分離株MN078268、美國分離株MH447033 核苷酸序列同源性相對較低，分別為98.3%、97.1%、95.4%、98.3%、98.2%、95.9%、95.9%。TL 與大連分離株KF495200 位于同一分支，親源性最近，且二者存在2 處堿基缺失，分別為第959 和981位處缺失堿基C 和A。見圖5。

圖4 16S rRNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile of PCR product of 16S rRNA

圖5 16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene

2.7 分離菌株的動物致病性試驗結(jié)果 注射6 h后，低劑量組小鼠出現(xiàn)食欲廢絕、精神不振現(xiàn)象；高劑量組小鼠中，有1 只出現(xiàn)呼吸急促、倒地不起，另外2 只死亡；注射12 h 后，高劑量組小鼠全部死亡。試驗期間對照組小鼠全部存活，未見異常。表明分離獲得的金黃色葡萄球菌致病性較強。

2.8 動物臟器病理組織觀察 鏡下觀察可見，肝細胞板斷裂，肝細胞壞死、溶解、消失，肝血竇擴張；肺臟肺泡擴張，其中肺泡膈斷裂增厚，支氣管黏膜脫落，多數(shù)假復(fù)層柱狀細胞壞死，細胞核濃縮、核深染；心臟心肌纖維斷裂肥大、有瘢痕組織形成；腎臟中腎小球血管集處系膜細胞和內(nèi)皮細胞增生，尿囊處內(nèi)皮細胞壞死，呈均質(zhì)化；脾臟生發(fā)中心外緣大量淋巴細胞發(fā)生壞死。見圖6。

圖6 猝死牛各臟器病理組織切片的鏡下觀察Fig.6 Pathological examination of various organs of cattle which died suddenly

3 討論

金黃色葡萄球菌為常見易導(dǎo)致牛乳房炎的致病菌，嚴重影響產(chǎn)乳量，降低養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益。該菌常規(guī)鑒定方法有血漿凝固酶法、生化檢測法、免疫學(xué)檢測法及分子生物學(xué)檢測等［10-13］。本研究從猝死牛內(nèi)臟分離獲得1 株菌株，經(jīng)上述方法鑒定，確定為金黃色葡萄球菌，且具有較強的致病性。因此確定該菌為引起牛發(fā)生猝死的病原菌。謝昆等［14］研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的耐藥性具有地域差異性。本研究結(jié)果表明，獲得的分離菌株對青霉素抗性較強，該結(jié)果與吳金花等［15］于內(nèi)蒙古通遼市所分離菌株的藥物敏感性結(jié)果不符，表明該菌的藥物敏感性發(fā)生了改變。系統(tǒng)進化樹分析可知，分離菌與大連分離株KF495200 位于同一分支，核苷酸序列同源性為99.3%，且二者存在2 處堿基缺失，分別為第959 和981 位處缺失堿基C 和A。這些堿基的缺失與細菌毒力變化的相關(guān)性有待進一步驗證。

金黃色葡萄球菌含有2 種凝固酶，一種與菌體表面結(jié)合不釋放，另一種分泌至菌體外，可使血漿發(fā)生凝固。凝固酶與細菌的毒力緊密相關(guān)，致病性菌株進入機體后，可使血液中的纖維蛋白凝集在細菌菌體的表面，阻止宿主體內(nèi)吞噬細胞的吞噬作用，即使被其吞噬后，也不易被胞內(nèi)殺滅。因此，血漿凝固酶試驗是判定葡萄球菌毒力強弱的標準之一。本實驗結(jié)果顯示，血漿凝固酶試驗結(jié)果呈陽性，菌株對諾氟沙星、呋喃唑酮、克林霉素等藥物敏感；動物實驗結(jié)果還表明，菌株可導(dǎo)致小鼠死亡。因此判斷該株金黃色葡萄球菌屬于致死性金黃色葡萄球菌。

杜琳等［16］對中國5 個省市自治區(qū)的乳房炎奶牛所產(chǎn)牛乳中致病性金黃色葡萄球菌進行檢測，結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌的分離率為12.15%。錫林高娃等［17］對內(nèi)蒙古通遼市主要產(chǎn)奶地區(qū)進行同樣的調(diào)查，結(jié)果顯示，采集的19 份牛乳中共分離出24株金黃色葡萄球菌，上述研究表明金黃色葡萄球菌對奶牛的感染率較高，通遼市作為牛養(yǎng)殖聚集地，感染該菌的風(fēng)險遠高于其他地區(qū)。本研究從通遼地區(qū)分離獲得的金黃色葡萄球菌對牛具有致死性，表明金黃色葡萄球菌的致病性有進一步增強的可能，本研究為當?shù)嘏ｂ腊Y的流行病學(xué)調(diào)查及金黃色葡萄球菌病的預(yù)防提供了實驗依據(jù)。