劉飛祥 樊巧玲 譚峰 李星 麥聰英 葉素敏 張明玥 柴毅 吳丹

南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京210023

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種慢性、持續(xù)存在的全身性骨骼疾病，其主要特征為骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)改變以及骨脆性增加[1]。OP及OP性骨折易發(fā)生在55歲以上婦女和65歲以上男性中，其較高的致殘率和致死率，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命安全。骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國60歲以上女性2型糖尿病患者OP患病率高達(dá)40.1%，60歲以下患病率為26.5%，而北京市絕經(jīng)后婦女患者的椎體骨折的患病率從60歲以下的13%上升到80歲以上的50%[2-3]。結(jié)合我國人口基數(shù)大和社會步入老齡化階段的實際情況，OP及OP性骨折將對醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。左歸丸出自《景岳全書·新方八陣》，由菟絲子、山藥、枸杞子、鹿角膠、熟地黃、山茱萸、龜甲膠和川牛膝八味藥物，治療“真陰腎水不足……或腰酸腿軟，精髓內(nèi)虧、津液枯涸等證”。實驗表明[4-5]，左歸丸能顯著提高去卵巢大鼠骨密度水平，改善骨顯微結(jié)構(gòu)，同時也能明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞方向分化，然而其分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬進(jìn)一步探討左歸丸促進(jìn)BMSCs增殖和向成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制，明確左歸丸補(bǔ)腎壯骨的作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物和細(xì)胞：20只8周齡SPF級SD大鼠均由南京市青龍山動物繁殖中心提供，合格證號為SCXK(SU)2017-0001，動物在南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心喂養(yǎng)。本研究的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自課題組的自提細(xì)胞，其形態(tài)、表面抗體及向成骨、成脂細(xì)胞方向分化的能力已在前期實驗中鑒定完畢[5]。本次動物實驗研究方案獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的同意(倫理號：201803A002)。

1.1.2中藥：菟絲子、山藥、枸杞子、鹿角膠、熟地黃、山茱萸、龜甲膠和川牛膝購買于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，藥材質(zhì)量均為合格產(chǎn)品。

1.1.3試劑和儀器：BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)測試盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：C3206，P0321 S)；Rabbit anti-Runx2，Rabbit anti-ALP，Anti-Osteocalcin(OPN)和Actin由Abcam生物科技有限公司提供(批號分別為：ab76956，ab154100，ab133612，ab8226)；胎牛血清(FBS)由以色列BI公司提供(批號：01-042-1ACS)；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C購買自Sigma公司(批號分別為：50020，D4902，1043003)。

EnSpire型酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer)；imagequant las 4000型超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE通用)；Mini-protean Tetra 型Bio-rad蛋白電泳儀/伯樂小型垂直電泳槽(美國 伯樂)。

1.2 方法

1.2.1藥物制作：中藥(龜甲膠和鹿角膠除外)粉碎后分別煎煮2 h，然后過濾濃縮，烊化龜甲膠和鹿角膠，上Freeze Dryers凍干機(jī)-50 ℃干燥48 h，低溫干燥保存。

1.2.2含藥血清制備：20 只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后分別給予ZGW灌胃(4.6 g/kg凍干粉)和等體積純水灌胃7 d(n=10只)。末次給藥2 h后，取全血，在4 ℃冰箱靜置4 h，3 000 r/min離心 15 min，然后血清過濾、除菌、滅活，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3試劑配制：10% FBS DMEM：89 mL DMEM培養(yǎng)液，10 mL FBS，1 mL青鏈霉素。成骨誘導(dǎo)液：89 mL DMEM培養(yǎng)液，10 mL大鼠BMSCs專用胎牛血清，1 mL青鏈霉素，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，10-7mol/L地塞米松，50 μg維生素C。2.5%空白大鼠血清-成骨誘導(dǎo)液組：86.5 mL DMEM培養(yǎng)液，10 mL大鼠BMSCs專用胎牛血清，2.5 mL空白組大鼠血清，1 mL青鏈霉素，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，10-7mol/L地塞米松，50 μg維生素C。2.5%左歸丸含藥血清-成骨誘導(dǎo)液：86.5 mL DMEM培養(yǎng)液，10 mL大鼠BMSCs專用胎牛血清，2.5 mL左歸丸灌胃組大鼠血清，1 mL青鏈霉素，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 μg維生素C，10-7mol/L地塞米松。

1.2.4含藥血清對BMSCs的增殖實驗：按照0.25×104/孔的密度，將P3 BMSCs接種于7個96孔板中。將細(xì)胞分為10% FBS DMEM組(Control)、成骨誘導(dǎo)液組(OIS)、2.5%空白大鼠血清-成骨誘導(dǎo)液組(ROIS)、2.5%左歸丸含藥血清-成骨誘導(dǎo)液組(ZGWOIS)，并給予相應(yīng)藥物干預(yù)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，4個空白孔。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱分別孵育1、2、3、5、7、9、11 d，每孔分別加入50 μL 1×MTT試劑，置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，然后吸取培養(yǎng)液，加150 μL/孔DMSO，恒溫箱中搖勻10 min，在酶標(biāo)儀上以波長為550 nm進(jìn)行檢測。

1.2.5堿性磷酸酶法對細(xì)胞AKP檢測：按照3×104/孔的密度，將P3 BMSCs接種于6孔板。10% FBS DMEM孵育細(xì)胞融合到70%左右，細(xì)胞分組同上，分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，2個空白孔，每2 d更換培養(yǎng)液，在第3、7天時，取細(xì)胞上層培養(yǎng)液，按照操作流程檢測培養(yǎng)液中的AKP濃度。

1.2.6堿性磷酸酶鈣鈷染色：按照3×104/孔的密度，將P3 BMSCs接種于6孔板。10% FBS DMEM孵育細(xì)胞融合到70%左右，細(xì)胞分組同上，并給予相應(yīng)的藥物干預(yù)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，2個空白孔，每2 d更換培養(yǎng)液，第7天吸取培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，10%多聚甲醛固定1 h，PBS洗滌2次，按照0.5 mL/孔的體積吸取堿性磷酸酶鈣鈷染色液覆蓋6孔，避光染色30 min，雙蒸水緩慢沖洗，倒置相差顯微鏡觀察。

1.2.7Western bloting檢測BMSCs中相關(guān)蛋白的水平：按照3×104/孔的密度，將P3 BMSCs接種于6孔板。10% FBS DMEM孵育細(xì)胞融合到70%左右，細(xì)胞分組同上，分別給予相應(yīng)的藥物干預(yù)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，2個空白孔，置37 ℃5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，每2～3 d更換培養(yǎng)液，第7天吸取培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，按照150 μL/孔的比例加入裂解液提取總蛋白。然后檢測蛋白濃度，用SDS-PAGE分別分離出總蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜中。分別給予兔抗Runx2(1∶1 000)、兔抗ALP(1∶1 000)、兔抗OPN(1∶1 000)和兔單克隆-actin蛋白(1∶2 000)孵育8 h。PBST清洗3次后，分別使用山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)或山羊抗兔IgG(1∶2 000)在搖床上孵育2 h。用PBST清洗3次后進(jìn)行曝光，Image J軟件分析和檢測灰度值，actin作為參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對BMSCs增殖的影響

與Control組比較，OIS、ROIS和ZGWOIS組中BMSCs的生長曲線呈S形，符合BMSCs的生理特性。與Control組比較，從第3天開始，OIS、ROIS和ZGWOIS組中的BMSCs增殖速度加快，提前進(jìn)入平臺期，ZGWOIS組的細(xì)胞增殖能力優(yōu)于其他兩組(圖1)。

圖1 ZGW對不同組別BMSCs增殖的影響Fig.1 Effect of ZGW on BMSCs proliferation

2.2 對細(xì)胞中AKP含量的影響

與Control組比較，在孵育3 d時，OIS組AKP未見明顯升高，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在孵育7 d時，與OIS組相比，ZGWOIS組培養(yǎng)液中AKP含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而ROIS組中AKP含量未見明顯升高(表1)。

表1 左歸丸對不同組別AKP的影響Table 1 Effect of ZGW on AKP

2.3 對堿性磷酸酶鈣鈷染色的影響

與Control組比較，OIS組的染色明顯較深；與OIS組比較，ZGWOIS組BMSCs中的染色明顯較深，ROIS組未見明顯差異(圖2)。

圖2 左歸丸對不同組別BMSCs堿性磷酸酶鈣鈷染色的影響(×40)Fig.2 Effect of ZGW on alkaline phosphatase calcium cobalt staining in BMSCs (×40)注：A：10% FBS DMEM組；B：成骨誘導(dǎo)液組；C：2.5% 空白大鼠血清-成骨誘導(dǎo)液組；D：2.5%左歸丸含藥血清-成骨誘導(dǎo)液組。

2.4 對BMSCs中Runx2、ALP和OPN蛋白的影響

與Control組相比較，OIS組中Runx2、ALP和OPN蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與OIS組相比，ZGWOIS組中Runx2、ALP和OPN蛋白明顯升高，而ROIS組中Runx2、ALP和OPN蛋白未見明顯變化(圖3，表2)。

圖3 ZGW對不同組別BMSCs中Runx2、ALP和OPN蛋白的影響(n=3)Fig.3 Effect of ZGW on proteins of Runx2, ALP, and OPN in BMSCs (n=3)注：A：10% FBS DMEM組；B：成骨誘導(dǎo)液組；C：2.5% 空白大鼠血清-成骨誘導(dǎo)液組；D：2.5%左歸丸含藥血清-成骨誘導(dǎo)液組。

表2 ZGW對不同組別BMSCs中Runx2、ALP和OPN蛋白的影響

3 討論

OP屬于中醫(yī)“骨痿”“骨枯”等疾病范疇，其病機(jī)多屬腎精虧虛，治法以補(bǔ)腎填精、益髓壯骨為主。多項臨床試驗表明[6-8]，左歸丸能顯著改善OP患者的腰背疼痛、腰部功能障礙等癥狀，提高機(jī)體骨密度水平，降低OP性骨折發(fā)生的風(fēng)險。而動物實驗發(fā)現(xiàn)[9]，左歸丸可顯著降低大鼠血清中Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽和抗酒石酸堿性磷酸酶b水平，提高血清中ALP、骨鈣素和骨保護(hù)素含量，調(diào)節(jié)骨保護(hù)素/核因子κB受體激活因子配體/核因子κB受體活化因子等多條通路，從而增加骨密度，改善骨顯微結(jié)構(gòu)水平。這些研究明確了左歸丸對骨調(diào)控的分子機(jī)制，闡釋了中醫(yī)“髓養(yǎng)骨”的科學(xué)內(nèi)涵，豐富了中醫(yī)“腎主骨生髓”的藏象理論。

BMSCs一方面參與骨髓環(huán)境構(gòu)建，并可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，為骨形成提供細(xì)胞來源；另一方面，BMSCs由其分化而來的成骨細(xì)胞一起參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟和凋亡，從而調(diào)節(jié)骨代謝的平衡[10-11]。Runx2是骨骼發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，在BMSCs、成骨細(xì)胞系細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)，其通過調(diào)節(jié)Ihh基因表達(dá)來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，決定了軟骨細(xì)胞是形成暫時性軟骨還是永久性軟骨[12]。Runx2對成骨細(xì)胞分化至關(guān)重要，是骨祖細(xì)胞增殖所必需的。一方面，Runx2能夠誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨祖細(xì)胞向前成骨細(xì)胞分化[13]；另一方面，Runx2誘導(dǎo)Sp7表達(dá)，促進(jìn)前成骨細(xì)胞分化為未成熟成骨細(xì)胞，以及通過直接調(diào)節(jié)Fgfr2和Fgfr3的表達(dá)來誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞的增殖[14]。此外，Runx2通過誘導(dǎo)hedgehog、Fgf、Wnt和Pthlh信號通路基因在骨中的表達(dá)，從而誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞的增殖并向成骨細(xì)胞系細(xì)胞分化[15]。OPN是一種分泌性磷蛋白，是細(xì)胞基質(zhì)蛋白小整合素結(jié)合配體N-連接糖蛋白家族的成員，參與多種生物活性。研究表明[16]，OPN在骨代謝和體內(nèi)平衡中起著重要作用，其不僅是神經(jīng)元介導(dǎo)和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)骨量的重要因子，而且參與多種骨相關(guān)細(xì)胞，包括BMSCs、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、遷移和粘附等生物學(xué)活動。骨橋蛋白已被證實與許多骨相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨肉瘤[17]。ALP是生物礦化的重要組成部分，由骨質(zhì)中分泌出來的，是成骨細(xì)胞表型標(biāo)志物之一[18]。研究顯示，在BMSCs向成骨細(xì)胞分化以及成熟的過程中Runx2基因激活骨基質(zhì)蛋白，如ALP、OPN、骨涎蛋白等的表達(dá)，并調(diào)控骨形成的進(jìn)程[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸含藥血清能夠顯著上調(diào)BMSCs細(xì)胞中Runx2、ALP和OPN蛋白的表達(dá)，效果優(yōu)于單獨使用成骨誘導(dǎo)液，而空白組大鼠血清對相關(guān)蛋白未見明顯影響。基于Runx2蛋白對ALP和OPN的上游調(diào)控作用，說明左歸丸含藥血清是通過調(diào)節(jié)Runx2蛋白表達(dá)，激活A(yù)LP和OPN的表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs的增殖和向成骨細(xì)胞方向分化。

綜上所述，左歸丸通過激活Runx2蛋白，上調(diào)ALP和OPN蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了BMSCs的增殖和向成骨細(xì)胞方向分化，這從分子層面為闡釋左歸丸“補(bǔ)腎填精、益髓壯骨”抗骨質(zhì)疏松癥的主要作用機(jī)制提供了一定的參考依據(jù)。