曹振宇 沈曉鐘 馬建武 鄭峰

青海省人民醫(yī)院骨科，青海 西寧 810000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是骨質(zhì)質(zhì)量和微結(jié)構(gòu)的惡化，導(dǎo)致骨組織脆性增加，從而提高骨折發(fā)生幾率[1]。研究表明，OP患者的骨流失是骨形成減少和骨吸收增加引起的，成骨分化形成可受多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的調(diào)控[2-3]。近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其具有強(qiáng)大分化能力而成為治療OP的一個(gè)很有前途的工具細(xì)胞[4]。BMSCs是典型的具有自我更新能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞，可能是骨組織工程的潛在細(xì)胞來(lái)源，因此，誘導(dǎo)BMSCs成骨分化對(duì)于骨再生應(yīng)用與臨床上治療OP具有重要意義[5-6]。

積雪草是一種傘形科積雪草屬植物，積雪草苷是從積雪草中提取的一種白色針狀結(jié)晶物，主要成分是三萜皂苷[7]。積雪草苷長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是一種傷口愈合劑，同時(shí)具有抗炎、抗纖維化、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抑制瘢痕形成、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。積雪草苷已被證明對(duì)細(xì)胞成骨分化有顯著的積極影響[9]，有研究發(fā)現(xiàn)積雪草苷通過(guò)TGF-β/Smad通路抑制增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成，對(duì)糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能障礙具有保護(hù)作用[10]。但未發(fā)現(xiàn)有關(guān)積雪草苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化作用的相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TGF-β/Smads通路研究積雪草苷能否促進(jìn)BMSCs成骨分化，為臨床上治療OP提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：BMSCs購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑：積雪草苷購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%；CCK-8試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3和β-actin抗體均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；ALP、OPN和OCN引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Annexin V-APC/PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；一步法RT-qPCR試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.1.3儀器：Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士帝肯)、CKX53倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)、多功能凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、蛋白質(zhì)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Cytoflex流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將BMSCs置于完整的培養(yǎng)基(L-DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，按1∶2的比例進(jìn)行消化傳代2～3代，待細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后備用，細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)不能超過(guò)10代。

1.2.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的BMSCs消化重懸，將100 μL細(xì)胞懸液(1×104個(gè)/mL)加入96孔板。在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，然后用不同濃度的積雪草苷(0、5、10、20、30、40 μmoL/L)處理，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后在每個(gè)孔中加10 μL CCK 8試劑。孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的BMSCs消化重懸，以5×105個(gè)/mL濃度種植至6孔板中，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，然后用不同濃度的積雪草苷(0、5、10、20、30、40 μmoL/L)處理，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書操作，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4細(xì)胞分組：機(jī)制探索實(shí)驗(yàn)分成兩部分，第一部分分成2組：空白對(duì)照組與積雪草苷組(20 μmoL/L)；第二部分分成3組：空白組對(duì)照組、積雪草苷組(20 μmoL/L)與抑制組(20 μmoL/L積雪草苷+50 moL/L SB-431542)。

1.2.5細(xì)胞成骨分化檢測(cè)：將BMSCs按1.2.4進(jìn)行分組，以1×104個(gè)/mL濃度種植至12孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物處理12 d，每3 d更換一次培養(yǎng)液，藥物干預(yù)完成后用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛在37 ℃下固定30 min，然后用1%茜素紅染色30 min，觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.2.6細(xì)胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達(dá)水平的檢測(cè)：將BMSCs按1.2.4進(jìn)行分組與藥物干預(yù)12 d后，按照試劑盒說(shuō)明書試劑盒提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR擴(kuò)增過(guò)程為：95 ℃變性30 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCT反映細(xì)胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達(dá)水平。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡(Western blot)：收集各組細(xì)胞，使用RIPA裂解緩提取總蛋白并進(jìn)行定量，依次進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳(上樣量為40 μg)、轉(zhuǎn)移到PVDF膜、置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗：TGF-β1(1∶1000)、Smad2(1∶1000)、p-Smad2(1∶1000)、Smad3(1∶1000)和p-Smad3(1∶1000)和β-actin(1∶1500)。漂洗干凈后在室溫中孵育二抗(1∶5000)2 h，使用ECL法進(jìn)行顯影后置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 積雪草苷對(duì)BMSCs增殖、凋亡率的影響

與0 μmoL/L組相比，5、10、20 μmoL/L積雪草苷對(duì)BMSCs均無(wú)抑制與促凋亡作用(P>0.05)，30、40 μmoL/L積雪草苷均能降低BMSCs細(xì)胞增殖率，升高細(xì)胞凋亡率(P<0.01)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以20 μmoL/L積雪草苷為最大無(wú)毒濃度。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

表1 不同濃度積雪草苷對(duì)BMSCs增殖率的影響

圖1 不同濃度積雪草苷對(duì)BMSCs凋亡率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of asiaticoside on apoptosis rate of BMSCs注：A、B、C、D、E、F分別代表0、5、10、20、30、40 μmoL/L濃度的積雪草苷。

2.2 積雪草苷對(duì)BMSCs成骨分化的影響

20 μmoL/L積雪草苷對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)積雪草苷組礦化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯多于空白對(duì)照組。茜素紅染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度積雪草苷對(duì)BMSCs成骨分化的影響(茜素紅染色)Fig.2 Effect of asiaticoside on osteogenic differentiation of BMSCs (Alizarin red staining)注：A、B分別代表0、20 μmoL/L積雪草苷處理(圖中紅點(diǎn)為礦化結(jié)節(jié))

2.3 積雪草苷對(duì)BMSCs成骨分化基因表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，積雪草苷組細(xì)胞中ALP、OPN和OCN基因表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

2.4 積雪草苷對(duì)BMSCs中TGF-β/Smads通路的影響

與空白組相比，積雪草苷組細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.01)，Smad2與Smad3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化(P均>0.05)，詳見(jiàn)表3、圖3。

圖3 不同組別積雪草苷對(duì)BMSCs中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of asiaticoside on protein expression levels of TGF-β1, Smad2, p-Smad2, Smad3, and p-Smad3 in BMSCs

2.5 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對(duì)BMSCs骨分化的影響

與空白對(duì)照組相比，積雪草苷組細(xì)胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達(dá)水平升高(P均<0.01)。與積雪草苷組相比，抑制組細(xì)胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對(duì)BMSCs中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達(dá)的影響Table 4 Effects of asiaticoside on TGF-β1, ALP, OPN and OCN gene expression in BMSCs after inhibition of TGF-β/

茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，肉眼觀察3組礦化結(jié)節(jié)數(shù)目，積雪草苷組最多，抑制苷組次之，空白對(duì)照組最少。染色結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 積雪草苷對(duì)BMSCs成骨分化的影響(茜素紅染色)Fig.4 Effect of asiaticoside on BMSCs osteogenic differentiation (Alizarin red staining)注：A、B、C分別代表0、20 μmoL/L積雪草苷處理、50 nmoL/L SB-431542+20 μmoL/L積雪草苷處理

與空白對(duì)照組相比，積雪草苷組細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.01)，Smad2與Smad3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化(P均>0.05)；與積雪草苷組相比，抑制組細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Smad2與Smad3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。詳見(jiàn)表5、圖5。

表5 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對(duì)BMSCs中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3基因表達(dá)的影響

圖5 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對(duì)BMSCs中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of asiaticoside on the protein expression levels of TGF-β1, Smad2, p-Smad2, Smad3, and p-Smad3 in BMSCs after inhibition of TGF-β/Smads pathway

3 討論

BMSCs是骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞組分之一，是骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞的祖細(xì)胞，這些細(xì)胞參與了骨骼組織、造血支持基質(zhì)和脂肪組織的形成[11-12]，與調(diào)節(jié)造血、免疫、成骨等生理功能密切相關(guān)[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植被認(rèn)為是治療OP的一個(gè)有前途的策略，同種異體和自體BMSCs均有效[14-15]。BMSCs向脂肪細(xì)胞的偏分化可能導(dǎo)致成骨細(xì)胞的減少和OP發(fā)病增加。因此，各種可促進(jìn)BMSCs成骨分化的調(diào)控因子可能是治療OP的潛在治療藥物[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)積雪草苷對(duì)BMSCs具有良好的誘導(dǎo)成骨分化能力，對(duì)TGF-β/Smads通路也有一定的調(diào)節(jié)作用，是一種治療OP的潛在藥物。

眾所周知，TGF-β1是調(diào)節(jié)多種生理功能的關(guān)鍵因子之一。例如，TGF β1可以通過(guò)重組細(xì)胞骨架使祖細(xì)胞進(jìn)入成脂或成骨細(xì)胞譜系，從而提高間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力[18-19]。多種類型細(xì)胞及不同成熟階段的成骨細(xì)胞均能合成和分泌OPN，是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志[20]。ALP與OCN都是骨分化成熟的標(biāo)志，作為成骨細(xì)胞的標(biāo)記基因，ALP在早期成骨中發(fā)揮重要作用[21]，ALP在未成熟的骨前體細(xì)胞中不表達(dá)，但隨著成骨分化，ALP的表達(dá)逐漸增加[22]。ALP產(chǎn)生磷酸鈣沉積在成熟成骨細(xì)胞中，促進(jìn)成骨礦化，而OCN是參與礦化調(diào)控的最豐富的蛋白[23]。在本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs經(jīng)積雪草苷處理12 d后，TGF-β1、OPN、ALP與OCN的基因表達(dá)量升高，細(xì)胞成骨分化后礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量增加，說(shuō)明BMSCs細(xì)胞出現(xiàn)成骨分化且程度較高，證明積雪草苷對(duì)BMSCs細(xì)胞骨分化具有明顯誘導(dǎo)作用，其中涉及的機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

Smads蛋白是TGF-β超家族成員信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵，Smad2/3作為TGF-β的下游信號(hào)蛋白分子，可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用來(lái)調(diào)控靶基因的活性[24-25]。既往研究表明，OP患者外周血中TGF-β1表達(dá)降低，說(shuō)明TGF-β/Smads通路對(duì)OP進(jìn)程有密切聯(lián)系[26]，然而，積雪草苷誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞成骨分化的效果與TGF-β/Smads通路之間的聯(lián)系還不明確。本實(shí)驗(yàn)首先使用SB-431542抑制BMSCs細(xì)胞中的TGF-β/Smads通路，再使用積雪草苷進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)積雪草苷在TGF-β/Smads通路處于抑制狀態(tài)的情況下仍然能發(fā)揮誘導(dǎo)骨分化的效果，細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平升高，Smad2與Smad3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明積雪草苷能增加TGF-β1表達(dá)，促進(jìn)Smad2、Smad3磷酸化，對(duì)抗抑制劑產(chǎn)生的TGF-β/Smads通路抑制效果，從而誘導(dǎo)TGF-β1、OPN、ALP與OCN基因表達(dá)，促進(jìn)成骨分化形成鈣化結(jié)節(jié)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了積雪草苷具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨分化的潛力，可能涉及的機(jī)制為激活細(xì)胞中TGF-β/Smads通路，上調(diào)OPN、ALP與OCN基因表達(dá)量，幫助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完成成骨分化。