王令宇，劉司瑜，楊毓賢，王子誠，房經(jīng)貴，上官凌飛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095）

根據(jù)《中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截止到2019年，我國葡萄栽培面積已經(jīng)達到726.20 hm2，僅次于柑橘、蘋果和梨，居于第四位。葡萄是需肥量比較大的果樹，化肥的不合理使用，不僅會造成肥料的浪費，也會造成環(huán)境的污染。肥料的精準施用既可以節(jié)約肥料，均衡土壤養(yǎng)分，又可以減少環(huán)境污染，增加葡萄產(chǎn)量。

葉面施肥操作簡單、用量少，同時具有肥效快、利用率高、對環(huán)境污染小等優(yōu)點[1-2]。在葉面施肥過程中可以結(jié)合農(nóng)藥噴施，在一定程度上能夠減少勞動力的投入[3]。磷鉀是植物生長必需的元素，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用，對葡萄果實的發(fā)育尤為重要[4-5]。因此，在葡萄果實膨大前噴施KH2PO4可促進其迅速膨大，但是生產(chǎn)上對其噴施時期不能精準把控，造成肥料浪費等問題。因此，葡萄精準施肥在產(chǎn)業(yè)提檔升級和高質(zhì)量發(fā)展中顯得尤為重要。

基因的表達早于生物體性狀的變化，利用基因信息開發(fā)的生物標記已廣泛應(yīng)用于動物（花斑裸鯉等）、植物（水稻、菠菜、亞麻等）、人類（遺傳疾病等）等[6-10]。近幾年，已有相關(guān)研究報道指出，基于基因表達信息變化開發(fā)的生物標記可以用于指導(dǎo)葡萄生產(chǎn)，如利用葡萄氮代謝基因的表達評價不同氮肥肥效、利用鉀吸收相關(guān)基因評價葡萄葉面肥的效果和濃度、利用葡萄花果相關(guān)基因的表達情況來指導(dǎo)施肥等[11-14]。磷肥和鉀肥是葡萄果實膨大期所需的主要肥料，本研究選擇了7個磷鉀吸收相關(guān)的基因用于生物標記的開發(fā)。其中，VvKUP1、VvKUP2屬于KUP家族鉀轉(zhuǎn)運體，其功能是促進植物對鉀的吸收和維持細胞內(nèi)K+濃度。VvSORK、VvSIRK屬于shaker家族，VvSIRK為shaker家族內(nèi)向整流K+通道基因，主要功能為低親和吸收K+。VvSORK為shaker家族外向整流K+通道基因，VvPHT1-4、VvPHT2-1屬于PHT基因家族，為高親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，主要作用是從外界環(huán)境攝取磷酸鹽。磷調(diào)節(jié)子VvPHO1屬于高親和力磷轉(zhuǎn)運載體基因，增加植物磷元素的吸收[15-18]。本研究以‘陽光玫瑰’‘巨峰’葡萄為試材，在分子水平研究葉面噴施磷鉀肥的最佳時期，開發(fā)相關(guān)的生物標記，對葡萄的精準施肥具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料來源

試驗位于淮安市盱眙縣穆店鎮(zhèn)，江蘇省龍誠農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司基地?！薹濉汀柟饷倒濉咸丫鶠?年生，大H架設(shè)施栽培。園區(qū)為智能水肥一體化管理，土壤pH為5.8，有效磷含量為29.1 mg·kg-1、速效鉀含量為51.4 mg·kg-1。

KH2PO4購自南京化學(xué)試劑有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京TaKaRa有限公司。熒光定量染料SYBR GreenⅠ購自上海浦迪生物科技有限公司。所用引物由北京通用生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成（表1）。

1.2 肥料噴施處理

選取大面積種植園區(qū)，每個品種分別在坐果后7 d（6月7日，AFS7）、11 d（6月11日，AFS11）、15 d（6月15日，AFS15）選取發(fā)育基本一致的植株，選擇陰天或者上午9:00前對葡萄葉片正反面均勻噴施0.3%KH2PO4溶液，以葉面下滴溶液為止，每處理3次重復(fù)。4個處理記為T1（AFS7）、T2（AFS11）、T3（AFS15）和噴施清水的對照CK。在AFS3（6月3日）、AFS7（6月7日）、AFS11（6月11日）、AFS15（6月15日）、AFS19（6月19日）噴施之前采集第8～9節(jié)位的成熟葉片，并用液氮處理，放-80 ℃冰箱，用于測定葉片內(nèi)磷鉀吸收相關(guān)基因的表達。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生理指標

每個處理在噴施前采樣一次和噴施后每4 d隨機采集30粒果，最后一次采樣為坐果后27 d，用于果實縱橫徑以及粒質(zhì)量的測量。穗質(zhì)量和粒質(zhì)量用電子天平稱量，精確到0.01 g，取平均值。用游標卡尺隨機測量各個處理5粒果實的縱徑和橫徑，精確到0.01 cm，取均值。

1.3.2 RNA提取與cDNA的合成

總RNA提取采用改良CTAB法[19]，DNA去除使用TaKaRa試劑盒，RNA濃度使用超微量分光光度計（型號為Nanodrop-100a）檢測，完整性使用瓊脂糖電泳檢查。以提取的RNA為反轉(zhuǎn)錄模版，使用TaKaRa試劑盒（型號為ES10）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA置于-20℃貯藏，用于基因表達趨勢分析。

1.3.3 熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0軟件，分別設(shè)計看家基因以及與磷鉀吸收相關(guān)基因：Shaker家族內(nèi)向整流鉀離子通道（inward rectifying shaker-like K+channel, VvSIRK）、shaker家族外向整流鉀離子通道（shaker-like potassium channel, VvSORK）[12]；磷轉(zhuǎn)運體1-4（phosphate transporters1-4,VvPHT1-4）、磷轉(zhuǎn)運體2-1（phosphate transporters2-1,VvPHT2-1）、木質(zhì)部磷離子轉(zhuǎn)載轉(zhuǎn)運體1（Xylem phosphorusion transporter1,VvPHO1）、鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因1（Potassium protein, VvKUP1）、鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因2（Potassium protein, VvKUP2）等基因的定量PCR引物見表1。

以葡萄看家基因Actin為內(nèi)參，按照SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說明書，采用實時熒光定量PCR（realtime quantitative PCR, RT-qPCR）方法測定基因的相對表達量。反應(yīng)體系分為（1）擴增體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物為0.8 μL（表1），反應(yīng)MIX 10 μL，ddH2O 7.4 μL，總體系是20 μL。（2）程序是：95 ℃變性1 min，Tm退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，退火溫度58 ℃，反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲和熒光值變化曲線。3個重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)用Excel和LinReg PCR[13]軟件分析，采用2-△CT計算方法，以CK計算相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Fluorescent quantitative PCR primers

2 結(jié)果分析

2.1 不同時期噴施KH2PO4對果粒縱橫徑的影響

由表2可以看出，T3處理‘巨峰’果實縱徑和橫徑與CK差異顯著，縱徑增加大約21%，橫徑增加大約10%。由表2可以得到，經(jīng)施肥處理的‘陽光玫瑰’果實的縱橫徑與CK相比增加明顯，尤其是T3處理效果最好，縱徑與CK相比增加約17%，橫徑增加約15%。結(jié)果表明，在不同時期噴施的KH2PO4均促進了果實縱橫徑的增加，以T3效果最好。

表2 不同時期噴施KH2PO4對果實縱橫徑的影響Table 2 Effect of spraying KH2PO4 in different times on fruit vertical and horizontal diameter

2.2 不同時期噴施KH2PO4對果粒質(zhì)量的影響

葡萄果實粒質(zhì)量是評價果實外觀品質(zhì)的重要參考，也是本試驗最重要的一個指標。結(jié)果顯示，葉面噴施磷鉀肥均有效的增加了果粒質(zhì)量?！薹濉訲3施肥效果最好，如圖1A施肥處理較對照處理差異明顯，在噴后27 d，T3處理粒質(zhì)量已經(jīng)超過5 g，對照組不足4 g，增加約25%?！柟饷倒濉彩堑?次施肥效果最好，如圖1B，T3（AFS15）處理在噴后27 d時果實粒質(zhì)量達到了6.5 g以上，對照為5.5 g左右，增加大約為18%。

圖1 不同時期噴施磷酸二氫鉀對兩品種果粒質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of spraying KH2PO4 on fruit weight in different periods

2.3 不同時期葡萄葉片磷鉀吸收基因的表達情況

2.3.1 不同時期‘陽光玫瑰’葉片磷鉀吸收基因的表達

通過對‘陽光玫瑰’5個時期的葉片進行基因表達趨勢分析（圖2）可得：磷鉀吸收基因VvKUP1的表達趨勢先上升再下降，以AFS7表達量最高；VvKUP2的表達趨勢先降低再上升再降低，以AFS3和AFS11表達量較高。VvSORK的表達趨勢總體下降；VvPHT1-4的表達趨勢是先下降再上升，在AFS15表達量達到最大值然后下降。VvSIRK基因的表達趨勢是先上升再下降，以AFS11和AFS15表達量較高。VvPHT2-1表達趨勢是先下降再上升再下降，以AFS3表達量最高。VvPHO1基因的表達趨勢是先上升再下降，再上升，以AFS19表達量最高。經(jīng)過表型數(shù)據(jù)可得‘陽光玫瑰’最佳的施肥處理為T3，即花后15 d施肥最佳。此時，VvKUP2、VvPHT2-1基因表達趨勢表現(xiàn)為在AFS11上升、在AFS15下降；VvPHO1的表達趨勢都為AFS11下降，AFS15上升，VvPHT1-4的表達趨勢則為在AFS15突然上升并表達量到達最大值。

圖2 坐果后‘陽光玫瑰’葉片磷鉀吸收基因的表達情況Figure 2 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Shine Muscat' after fruit setting

2.3.2 不同時期‘巨峰’葉片磷鉀吸收基因的表達情況

圖3顯示，磷鉀相關(guān)基因在不同時期葉片的表達量不同，這可能與植株在各個時期所吸收的營養(yǎng)元素有關(guān)?！薹濉汀柟饷倒濉牧租浳障嚓P(guān)基因的表達趨勢大致相同，如‘陽光玫瑰’和‘巨峰’在最佳施肥時期時，VvKUP1基因都表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，VvPHO1的表達量都表現(xiàn)為先下降再上升的趨勢，VvSORK總體表現(xiàn)為下降的趨勢，VvPHT1-4、VvPHT2-1基因都是先下降再上升再下降的趨勢，VvSIRK表達量都是先上升后下降。VvKUP2基因的表達量在‘巨峰’中表現(xiàn)為先升高再降低，而在‘陽光玫瑰’中表現(xiàn)為先降低再上升再降低。經(jīng)過縱橫徑和粒質(zhì)量分析可得，‘巨峰’最佳的施肥處理為T3，VvKUP2、VvSORK基因的表達趨勢都表現(xiàn)為AFS11表達量上升、AFS15表達量下降；VvPHT2-1和VvPHO1的表達趨勢都為AFS711先下降，在坐果后AFS15再上升。

圖3 坐果后‘巨峰’葉片磷鉀吸收基因的表達情況Figure 3 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Kyoho' after fruit setting

2.4 生物標記的開發(fā)與利用

2.4.1 生物標記的開發(fā)

通過對‘陽光玫瑰’和‘巨峰’果實粒質(zhì)量和縱橫徑分析，確定出最佳施肥日期，再結(jié)合基因表達趨勢分析結(jié)果可以得出，VvSORK和VvKUP2基因的表達趨勢由上升轉(zhuǎn)為下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表達趨勢由下降轉(zhuǎn)為上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值為3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值為27～35時為最佳施肥日期（圖4）。綜合考慮可以作為確定最佳噴施膨果肥日期的判定依據(jù)，達到減肥增效的目的。

圖4 坐果后葉片VvPHO1-4/VvPHT2-1和VvPHO1/VvPHT2-1的比值Figure 4 The ratio of VvPHO1-4/VvPHT2-1 and VvPHO1/VvPHT2-1 of leaves after fruit setting

2.4.2 生物標記的利用

當‘巨峰’‘陽光玫瑰’果實坐果后，每隔3 d采集一次葉片，用于RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄，再進行熒光定量RCR分析是否符合標記規(guī)律。若符合，立即葉面噴施KH2PO4，此時噴施促進果實膨大效果最好，流程見圖5。

圖5 生物標記使用示意圖Figure 5 Biomarker diagram of biomarker utilization

3 討論

磷、鉀元素在植物細胞中較為豐富，對植物的生長發(fā)育具有重要的影響，如促進光合作用、維持滲透壓、調(diào)節(jié)氣孔和細胞伸長、提高葉片葉綠素含量等[20-21]。葉面施肥技術(shù)已經(jīng)在番茄、小麥、棉花等作物上廣泛使用和深入研究[22-24]。葡萄葉面噴施是彌補土壤缺肥的有效措施，具有利用率高、效果顯著、用肥少、見效快的特點[25-26]。本研究表明，對‘陽光玫瑰’‘巨峰’葉面噴施磷鉀肥均促進葡萄果實縱橫徑的增加和粒質(zhì)量的提高。

肥料施用的種類、濃度和時期是決定葉面肥效果的關(guān)鍵因素。不同時期的葡萄對磷鉀肥的要求不同，傳統(tǒng)施肥時期是基于樹木生長確定磷肥和鉀肥的需求判斷，屬于經(jīng)驗判斷，很難做到精準施肥[22-23]。傳統(tǒng)施肥不僅沒有最佳的施肥效果，也造成了肥料的浪費和環(huán)境的污染。開發(fā)用于施肥最佳時期判定的生物標記，利用分子診斷方法提前預(yù)測和精準判斷樹體生理狀況，可以做到精準施肥，減少肥料浪費[24-25]。

生物標記能夠精準鑒定有機體的生命狀態(tài)和生理階段，預(yù)判某種疾病是否存在[26-27]。隨著農(nóng)業(yè)科技的不斷發(fā)展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)逐步由“傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)”過渡走向“精準農(nóng)業(yè)”。農(nóng)業(yè)對精準的要求以及生物標記在生命體特征預(yù)判上的優(yōu)越性促進了生物標記在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，已經(jīng)成為精準農(nóng)業(yè)的重要依據(jù)。有很多研究證據(jù)表明，利用相關(guān)基因的表達情況，可以預(yù)測植物的營養(yǎng)狀況[1,28-32]。基因信息可以精準地反映植物體各種生理狀態(tài)，可以作為精準施肥的依據(jù)。

李傲等[29]研究表明，在葡萄果實膨大期噴施0.3%的KH2PO4的效果最好，可以促進果實膨大。在葡萄對磷鉀元素的研究中，主要聚集在根系吸收磷鉀元素和不同鉀肥種類對葡萄果實品質(zhì)的影響上，對于葉面噴施磷鉀肥最佳時期的判斷研究不多[33-37]。本試驗在果實膨大期進行葉面噴施KH2PO4，測定果實的粒質(zhì)量和縱橫徑，并采集不同時期的葉片用于測定葉片中磷鉀吸收相關(guān)基因的表達，結(jié)合生理和基因表達，篩選出一套可用于提前預(yù)測噴施膨果肥的最佳時期的生物標記。將來，可以開發(fā)快速檢測試劑盒，結(jié)合高密度田間采樣，實現(xiàn)葡萄大規(guī)模種植園的精準施肥管理，達到減少肥料施用和省工省力的目的。

4 結(jié)論

葉面噴施磷鉀肥可以有效促進果實增大，結(jié)合生理數(shù)據(jù)和基因表達，篩選出一套可作為噴施磷鉀肥最佳時期判定的生物標記，VvSORK和VvKUP2基因的表達趨勢由上升轉(zhuǎn)為下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表達趨勢由下降轉(zhuǎn)為上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值為3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值為27～35。