孫洋，王超霞，田淑芬*，劉丹，羅盼，王榮

（1. 天津農學院園藝園林學院，天津 300384；2. 天津市尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司，天津 300192）

花色苷是苯丙烷代謝途徑的主要物質，是自然界廣泛存在的類黃酮物質[1]。葡萄種植和釀酒加工過程中會產生大量枝條和果皮殘渣，其中仍含有豐富的花色苷，可用于一些高附加值保健食品的開發(fā)，具有廣泛的應用前景[2]。

MYB轉錄因子在葡萄花色苷的合成過程中起著決定性作用。根據葡萄基因組信息，預測有279個MYB轉錄因子[3]，從PlantTFDB上查詢到葡萄R2R3類MYB轉錄因子約有190個。根據蛋白質羧基端DNA結合區(qū)保守氨基酸的基序，這些R2R3類MYB轉錄因子可分為28個亞類，廣泛參與植物初生及次生代謝、細胞分化、激素信號傳導、生長發(fā)育調控、生物及非生物逆境響應等生命過程[4]。其中MYBAl和MYBA2這兩個位于2號染色體上的基因位點對葡萄的顏色起決定性影響。它們形成一個高度交聯(lián)的基因簇，長度約為200 kb，通過調控UFGT基因的表達來實現(xiàn)對花色苷合成的作用[5-7]。在各種葡萄品種中，MYBAl基因位點的基因型主要包括VvmybAla、VvmybAlb和VvmybAl等位基因。在葡萄發(fā)育過程中，將逆轉錄轉座子Gretl（Retrotransposon 1）插入VvmybAl編碼序列的上游啟動子區(qū)域會導致花色苷相關基因的表達受到抑制，從而使葡萄皮無法合成花青素，所以會出現(xiàn)綠色葡萄果實[7-9]。VvmybAlb和VvmybAl具有通過調節(jié)UFGT的表達而促進花色苷合成的功能[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，花色苷合成相關基因的啟動子序列上存在MYB4結合的順式作用元件，據此推測，MYB4b作為MYB家族的成員之一，可能參與調控果實花色苷的合成。

‘摩爾多瓦’（Moldova）葡萄于1997年從羅馬尼亞引入，原產地為摩爾多瓦共和國。該品種為歐美雜交種，果實著色力強，能有效抵抗霜霉病的侵染，對天氣的包容度極高。天津地區(qū)的氣候特點是季節(jié)氣候變化明顯，干旱多風，土壤鹽漬化程度高，因此，‘摩爾多瓦’葡萄適合在天津種植。為了解‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b轉錄因子的相關生物學功能，提高其利用效率，試驗利用PCR技術克隆獲得MYB4b轉錄因子的基因序列，并對其進行生物信息分析與預測，采用熒光定量PCR方法檢測MYB4b基因在‘摩爾多瓦’不同組織部位和不同農藝技術處理下的轉錄表達水平，同時檢測了相應的花色苷含量，為研究其在葡萄生理脅迫過程中所作出的調控應答奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

試驗于2021年8月5日至2021年12月25日在天津市武清區(qū)金鍋農業(yè)生態(tài)園進行?！柖嗤摺咸褳槎嗄晟愿?，棚架栽培，定植株距1.0 m，行距3.0 m，棚架高4 m。每株葡萄結果主蔓1個，每果枝保留1穗果，整株保持40穗。

采集了花前7 d（7 dbf）、花期（0 daf）和花后7 d（7 daf）的花序、莖尖、幼莖、老莖、新葉、老葉、幼卷須、老卷須，以及不同發(fā)育時期的果實：幼果期（開花后14 d）、轉色期（開花后56 d）及成熟期（開花后126 d）。采集‘摩爾多瓦’轉色期的果實進行無菌水（CK）、0.3% NaCl、60 g·L-1PEG6000、40 mg·L-1碧護、500 mg·L-1殼聚糖共計5個浸泡處理，取處理0、3、6、12、24 h，2、4、6、8 d（10個時間點）的樣品進行檢測，3次重復。樣品采集后存于液氮，用于RNA提取。

1.2 總DNA提取及目標基因克隆

用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒（9768，TaKaRa）提取葡萄葉片總DNA，具體提取方法參照試劑盒說明書。

在NCBI中獲得MYB4b的全長序列，并采用Primer 5軟件設計引物（表1）。PCR擴增目標基因，回收純化特異性擴增產區(qū)與天根的pGM-T載體連接并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，藍白斑篩選后將陽性菌液送生工生物工程股份有限公司進行測序。

表1 本文所采用的引物信息Table 1 Primer information used in this paper

1.3 生物信息學分析

采用ProtParam預測蛋白理化性質；SignalP 4.1 Server預測信號肽；ProtScale預測親水性/疏水性；TMHMM-2.0 Server預測跨膜區(qū)；NCBI的CDD（Conserved Domain Database）預測功能結構域；SOPMA預測蛋白質二級結構及三級結構；Psort和Cell-PLoc 2.0進行亞細胞定位；MEGA 5.1進行氨基酸序列多重比對和系統(tǒng)進化樹分析。

1.4 總RNA提取及實時熒光定量PCR

用HiPure Plant RNA mini Kit試劑盒（R4151-02，Magen）提取成熟葉、幼嫩葉、幼莖、老莖、幼卷須、老卷須、莖尖，以及各個階段的花序和果實總RNA，反轉錄后得到cDNA。按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）的操作指導，在Illumina-Eco熒光定量PCR儀（美國ABI）上測定基因的表達量。

以延伸因子EF-1α為內參基因進行熒光定量PCR，采用Primer5軟件設計相關引物（表1）。10 μL反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、上下游引物（10 mmol）各0.3 μL、cDNA模板1 μL和RNase-free水3.4 μL。反應條件：98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；最后進行溶解曲線測定。熒光定量結果通過相對定量法（2-△△t）進行分析，采用Excel軟件繪圖。

1.5 總花色苷含量測定

總花色苷含量用鹽酸甲醇法測定，具體方法參照洪燕紅的試驗方法[11]。

2 結果與分析

2.1 MYB4b基因克隆與序列分析

用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒（9768，TaKaRa）提取葡萄葉片總DNA凝膠電泳結果顯示提取的DNA條帶清晰完整（圖1左），Nanodrop 2000微量紫外分光光度計檢測結果得到所提DNA的濃度為324.54 μg·μL-1，OD260/280的比值為1.84。結果表明所提的基因組DNA濃度和純度滿足后續(xù)試驗的要求。

從電泳圖（圖1中）中可以看出，PCR擴增得到大小不同的多個片段。根據DNA marker的位置和預期目標產物的大小，將700～1000 bp大小的電泳條帶均進行切膠回收。根據TA克隆載體的重組原理，藍白斑篩選結果顯示（圖1右），藍色菌落中不含目的片段，白色菌落可能含有目的片段。

圖1 ‘摩爾多瓦’葡萄基因組DNA（左）和PCR產物（中）電泳圖及藍白斑篩選圖（右）Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA (left) and PCR products (middle) and blue and white spot screening map (right) of 'Moldova'

Sanger測序結果分析表明，PCR克隆得到的片段即為MYB4b基因序列，該基因含有2個外顯子，1個內含子，轉錄的mRNA序列總長為729 bp，共編碼242個氨基酸，單鏈分子量為27 311.04 （表2）。

表2 MYB4b基因序列分析Table 2 Sequence analysis of MYB4b gene

2.2 生物信息學分析

利用ProtParam在線軟件預測一級結構和理化性質，MYB4b蛋白分子式為C1178H1880N360O357S16，原子總數為3791，分子量為27311.04。理論等電點pI為8.47，為堿性蛋白。氨基酸組成Leu最多，占11.2%；Gln最少，占0.4%；未出現(xiàn)Pyl、Sec。帶正電荷氨基酸殘基總數（Asp＋Glu)為33，帶負電荷氨基酸殘基總數（Arg＋Lys)為37。脂溶系數為73.35，總平均疏水系數為-0.705，屬于疏水性蛋白。半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數55.60，根據不穩(wěn)定參數值在40以下才是穩(wěn)定蛋白的標準，可推測MYB4b翻譯出來的蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

使用NCBI的Conserved Domain Database數據庫對所獲得的‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b蛋白的氨基酸序列進行保守結構域分析（圖2）。結果表明，MYB4b蛋白在第1～131個氨基酸之間含有一個PLN03091功能結構域，該結構為轉錄阻遏型因子MYB5的保守結構域，E-value為6.1e-73，且PLN03091是超家族cl33633的唯一成員。

圖2 MYB4b蛋白保守結構域預測分析Figure 2 Prediction and analysis of conserved domain ofMYB4bprotein

使用在線軟件預測‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b蛋白的二級和三級結構（圖3）。MYB4b蛋白的二級結構中，主要是有123個氨基酸位點形成無規(guī)則卷曲，占比達到了50.83%；其次為80個氨基酸位點形成的α-螺旋占比達到33.06%，24個氨基酸位點形成的β-折疊占比達到9.92%，15個氨基酸位點的β-轉角占比達到6.20%。MYB4b蛋白的三級結構與二級結構特點相吻合，為螺旋-折疊-無規(guī)則卷曲。

圖3 MYB4b蛋白二級結構（左）和三級結構（右）預測Figure 3 Secondary (left) and three-level (right) structures prediction of MYB4b protein

2.3 MYB4b蛋白系統(tǒng)進化分析

采用在線軟件ProtScale對‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b蛋白氨基酸序列進行親水性/疏水性預測。由圖4可知，MYB4b蛋白在多肽鏈第162位氨基酸最低分值為-3.144，疏水性最強；而在蛋白多肽鏈第200位氨基酸親水性分值最高，為1.856，疏水性最弱?？傮w而言，MYB4b蛋白氨基酸序列親水氨基酸分布較均勻，且親水氨基酸數量多與疏水氨基酸，總體平均疏水系數為-0.705。因此推測MYB4b蛋白為親水蛋白。

圖4 MYB4b蛋白親水性/疏水性預測Figure 4 Prediction of hydrophobicity/hydrophobicity of MYB4b protein

系統(tǒng)發(fā)育進化分析結果表明（圖5），目的基因MYB4b與刺葡萄（Vitis davidii）的MYB相關蛋白308的編碼基因和河岸葡萄（Vitis riparia）的MYB4a轉錄因子同源性最高，表明兩者親緣關系較近。與其他物種的MYB序列聚類分析發(fā)現(xiàn)，葡萄MYB4b與擬南芥的同源關系較近，反而與葡萄的其他轉錄因子，如MYB14、MYB15的親緣進化關系相對較遠。此外，對葡萄不同MYB轉錄因子進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，相比對VvMYB24、VvMYB44、VvAPL來講，MYB4b與MYB14、MYB15的同源性相對較高，但處在不同分支。由此推測在葡萄進化過程中，MYB4b、MYB14/15和VvMYB24/44，可能來自不同的進化途徑，屬于不同的R2R3-MYB亞型。

圖5 MYB轉錄因子系統(tǒng)進化樹Figure 5 Phylogenetic tree of MYB transcription factors

2.4 不同組織MYB4b基因的表達模式及花色苷分布

如圖6所示，在‘摩爾多瓦’葡萄不同時期的花序、莖尖、幼莖、老莖、新葉、老葉、幼卷須、老卷須，以及不同時期的葡萄果實（幼果期、轉色期及成熟期）中均檢測到MYB4b基因的表達，但在各組織中的表達量不同。其中，在莖尖和花序（7 dbf）中的表達量較高，其次是花序（0 daf）中，而在幼果期果實中的表達量較低（圖6）。比較MYB4b基因在老葉和新葉中的表達發(fā)現(xiàn)，MYB4b在老葉中的表達量高于新葉。

圖6 不同組織部位的MYB4b基因的組織表達模式（左）及花色苷含量（右）Figure 6 Relative expression of MYB4b (left) and anthocyanin contents (right) in different tissue parts

如圖6所示，‘摩爾多瓦’葡萄不同組織部位中均含有花色苷。其中，花色苷在葡萄果實成熟期含量顯著高于其他組織部位，是花序（7 dbf）中花色苷含量的3.6倍，是花序（7 daf）中花色苷含量的50倍。比較花色苷在老葉和新葉的含量發(fā)現(xiàn)，老葉（0.756 mg·g-1）中的花色苷含量略高于新葉（0.737 mg·g-1）；比較花色苷在老卷須和幼卷須的含量發(fā)現(xiàn)，老卷須（0.149 mg·g-1）中的花色苷含量低于新卷須（0.444 mg·g-1）。

2.5 離體處理對MYB4b的基因表達和花色苷的影響

由圖7可知，鹽脅迫下，果實中MYB4b基因的表達呈先升高后下降趨勢，以處理6 h的MYB4b的表達量最高，之后逐漸回落。PEG誘導的干旱處理中，處理3 h的表達量較處理前顯著上升，24 h明顯回落，但處理6 d的表達量再次顯著上升。葡萄果實在碧護處理中，MYB4b基因的表達量在處理的各個時間點均顯著低于0 h，但6、12、24 h時均顯著高于同時期的清水處理，而處理2、4、8 d，MYB4b基因的表達量明顯下調，顯著低于處理前。葡萄果實在殼聚糖處理12 h前MYB4b基因的表達逐漸增加，在12 h達到最高值，隨后MYB4b基因的表達開始降低，自2 d開始各處理時間點MYB4b基因的表達量均低于處理前。上述結果表明，0.3%鹽、PEG6000、碧護和殼聚糖處理下調MYB4b基因的表達，其中0.3%鹽和殼聚糖的下調表達更強烈。

圖7 離體處理下MYB4b基因的表達變化Figure 7 Expression changes of MYB4b gene under in vitro treatment

由圖8可知，鹽脅迫下（圖8A），果實中花色苷的含量變化先增加后減少，以處理6 h花色苷的含量最高，處理6 h后，花色苷的含量逐漸回落，在處理4 d時達到次高值。PEG誘導的干旱處理（圖8B），果實中花色苷的含量變化先增加后減少，以處理4 d時花色苷的含量最高，顯著高于其他組織部位，是處理0 h的5.8倍。碧護處理中（圖8C），花色苷含量在處理6 h時達到最高值，6 h后逐漸降低，在處理6 d時有所回升，卻仍低于處理6 h的花色苷含量，是處理6 h的0.65倍。殼聚糖處理中（圖8D），果實中花色苷的含量變化先減少后增加，以處理4 d時花色苷的含量最高，顯著高于其他組織部位，處理0 h的花色苷含量為次高值。上述結果表明，0.3%鹽、PEG6000、碧護和殼聚糖處理均可促進花色苷的合成，但花色苷含量最高的出現(xiàn)時間不同，其中0.3%鹽和碧護處理均在處理6 h時花色苷含量最高，PEG6000和殼聚糖處理均在處理4 d時花色苷含量最高。

圖8 花色苷在0.3%鹽溶液（A）、PEG6000 (B)、碧護（C）和殼聚糖（D）處理中的含量Figure 8 Anthocyanin contents in in vitro treatment of 0.3% salt (A)、PEG6000 (B)、Bihu (C) and chitosan (D)

3 討論

MYB轉錄因子家族成員均含有MYB保守結構域[12]。在物種的進化過程中，基因的保守氨基酸序列變化很小，決定著基因的功能和類型。根據NCBI的CDD數據庫分析得到MYB4b蛋白在第1～131位堿基之間含有一個PLN功能結構域[13-14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，PLN保守結構可能是一個含有多個結構域的模型，是轉錄阻遏型因子MYB5的保守結構域，說明MYB4b轉錄因子屬于典型的MYB家族基因，可能具有轉錄抑制作用，其具體的功能有待進一步的試驗驗證。

由于轉錄調控因子需要與基因組DNA下游靶基因的順式作用元件相結合，從而發(fā)揮其對下游基因的激活或者抑制等調控作用。當轉錄調控蛋白在細胞質中完成翻譯修飾后，需要特定的核定位信號引導其從細胞質轉運到細胞核中，因此轉錄因子的亞細胞定位大多是在細胞核中，如PbMYB3R、VdMYB14轉錄因子的檢測與鑒定[15-16]。亞細胞定位預測結果表明，MYB4b轉錄因子定位于細胞核中，說明其含有的核定位信號，可將其翻譯修飾后的蛋白質從細胞質轉運到細胞核中，有助于其PLN保守結構域結合到基因組DNA上，從而發(fā)揮轉錄激活或抑制等調控功能。

在植物中，MYB基因家族具有悠久的進化歷史。早期的系統(tǒng)進化分析推測，在十億年前就出現(xiàn)了MYB結構域[17-18]。與動物相比，植物MYB基因家族系統(tǒng)性分化程度較低，數目眾多，加大了對其進化研究的困難[19-21]。本文MYB4b轉錄因子與其他物種以及葡萄其他MYB轉錄因子構建系統(tǒng)進化樹的結果表明，MYB4b與刺葡萄（Vitis davidii）的MYB相關蛋白的編碼基因以及河岸葡萄（Vitis riparia）的MYB4a轉錄因子同源性最高，表明兩者親緣關系較近。

MYB轉錄因子是植物中非常重要的一類轉錄因子，是花青素生物合成中MBW復合物的主要調控因子[22]。Zahra[23]等研究也發(fā)現(xiàn)，MYB影響植物中花青素、黃酮類化合物的合成。本研究通過組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)，MYB4b在‘摩爾多瓦’葡萄果實幼果期的表達量最低，在果實轉色期及成熟期低表達，推測其可能負調控葡萄果實花色苷的合成。此外，MYB4b與MYB14、MYB15的同源性相對較高，李慎昌[24]的試驗結果表明，VdMYB14能夠有效抑制花色苷的合成，推測MYB4b抑制花色苷的合成。

碧護是一種植物生長調節(jié)劑，其作用機理是讓植物獲得抗性物質，提高自我修復功能，它能激活植物體各種酶的活性，促使植物葉片把光合效能轉化為化學能[25]。殼聚糖在許多園藝作物中的應用潛力多有研究，包括誘導防御反應、改善農藝性狀、果蔬采后管理、促進植物生長和增強生理活性等[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，0.3%鹽、干旱、碧護和殼聚糖處理均下調MYB4b基因的表達，推測對花色苷的合成起促進作用。MYB4b基因是否對葡萄果實花色苷的合成有影響待進一步的驗證分析。

4 結論

本試驗通過PCR技術和TA克隆得到‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b基因序列，該基因編碼的蛋白質屬于親水性的非分泌堿性蛋白，系統(tǒng)進化樹顯示MYB4b基因與擬南芥的MYB4同源性較高，與VvMYB14/15的同源性相對較低，可能屬于不同的亞型。

MYB4b基因在不同組織部位均有表達，莖尖和花序（7 dbf）中的表達量較高，在幼果期的果實中表達量較低；同時受到0.3%鹽、PEG6000、碧護和殼聚糖處理的誘導表達，其中0.3%鹽和殼聚糖對MYB4b基因的下調表達更強烈。