程文娟，蘇穎玥，李瀟瀟，齊鵬宇，李軍，張進杰*

（1. 河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島 066004；2. 秦皇島海關技術(shù)中心/河北省葡萄酒質(zhì)量安全檢測重點實驗室，河北秦皇島 066000）

葡萄酒是一種廣泛消費的酒精性飲品，其質(zhì)量與安全問題越發(fā)受到人們的關注[1]。據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）全球葡萄酒行業(yè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，我國2020年葡萄酒生產(chǎn)量為6.6億升（位列世界第十），消費量達到12.4億升[2]。葡萄酒的品質(zhì)屬性與其產(chǎn)地緊密相關，許多國家和地區(qū)以生產(chǎn)高質(zhì)量葡萄酒而聞名[3]。由于優(yōu)質(zhì)葡萄酒通常具有較高經(jīng)濟價值，在利益的驅(qū)使下，一些不法商販制假造假，致使市場上存在著大量的低質(zhì)量高價格的葡萄酒[4]。為維護市場秩序和為葡萄酒產(chǎn)業(yè)提供強有力的技術(shù)支持，急需開發(fā)一種可靠有效的分析技術(shù)用于識別、監(jiān)管和追溯葡萄酒產(chǎn)地信息。

各國學者對產(chǎn)地溯源已進行了一系列探索性研究，主要基于礦質(zhì)元素指紋、穩(wěn)定同位素技術(shù)和某些特定的次生代謝產(chǎn)物[5]。礦質(zhì)元素指紋技術(shù)因具有靈敏度高、分析速度快、檢出限低等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于蜂蜜、茶葉、水產(chǎn)、牛肉等[6-9]農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源的研究中。近年來，該技術(shù)也被眾多國家應用于葡萄酒產(chǎn)地鑒別，并得到良好成效。意大利學者Bronzi等[10]發(fā)現(xiàn)，運用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定出31種元素，包括主要元素、微量元素和超痕量元素，結(jié)合偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）可以有效區(qū)分基安蒂產(chǎn)區(qū)與意大利其他產(chǎn)區(qū)的葡萄酒。葡萄牙學者Rocha等[11]研究表明，Ca、Li、Mn、Co、Zn、Br、Sr、Cd、Ba、W和Tl元素的濃度在葡萄牙6個不同地理標志保護產(chǎn)區(qū)（PGI）的葡萄酒中存在顯著差異，因此可以對來自不同PGI的葡萄酒進行有效鑒別。Yamashita等[12]評估了12種化學元素在阿根廷、巴西、法國和西班牙4個國家的111個起泡葡萄酒樣品的種類及含量，結(jié)果表明僅利用K、Li、Mn元素的分類準確率可達100%。

目前，我國雖已經(jīng)出臺葡萄酒地理標志產(chǎn)品保護規(guī)定，并建立了產(chǎn)品質(zhì)量安全可追溯制度與產(chǎn)品追溯和查詢系統(tǒng)，但相比于傳統(tǒng)葡萄酒生產(chǎn)國家，我國葡萄酒的產(chǎn)地鑒別技術(shù)仍處于起步階段。本文采用ICP-MS對來自于我國5個產(chǎn)區(qū)（東北、賀蘭山東麓、黃土高原、新疆及西南高山）共205款原產(chǎn)地葡萄酒樣品中的Li等28種礦質(zhì)元素進行測定，討論我國5個產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的多元素自然特征，并結(jié)合化學計量學方法對葡萄酒的產(chǎn)地進行鑒別，建立判別模型并驗證，旨在為我國葡萄酒產(chǎn)地溯源系統(tǒng)的建立和完善提供技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

為了盡量減少釀酒工藝對葡萄酒中天然礦質(zhì)元素的影響，試樣為不經(jīng)過澄清和陳年的2010—2014年份的葡萄酒。新疆產(chǎn)區(qū)（烏魯木齊、五家渠、昌吉、伊犁哈薩克及石河子）、賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)（青銅峽、銀川、烏海、石嘴山及鎮(zhèn)北堡）、黃土高原產(chǎn)區(qū)（銅川、涇陽、藍田、鄉(xiāng)寧、襄汾及鳴條崗）、西南高山產(chǎn)區(qū)（西昌、攀枝花、迪慶、彌勒、鹽井）葡萄酒樣品多為‘赤霞珠’‘美樂’；東北地區(qū)葡萄酒樣品多為‘北冰紅’‘威代爾’，每個產(chǎn)區(qū)酒樣數(shù)量分別為43、57、21、45和39款。有部分樣品使用兩種以上葡萄品種進行混釀。所有樣品酒發(fā)酵完成后自然澄清，罐裝于750 mL酒瓶中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品開啟后立即進行測定，3次重復。同一產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品做統(tǒng)一代碼標記：賀蘭山東麓（HL）、新疆（XJ）、西南高山（YCZ）、東北（DB）及黃土高原（HT）。另以相同方式收集并保存3個模型外樣品（DB、XJ、YCZ），供模型檢測使用。

1.2 試劑及儀器

MOS級硝酸：北京化學試劑研究所；超純水（18.2 MΩ·cm）：美國Millipore公司；Li、Be、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、La、Tl、Pb、Bi、U、Al、Ce、Mg、Cs和Sc 28種元素標準溶液100 mg·L-1，介質(zhì)為0.5% HNO3、2% HCl及1%HF：加拿大SCP SCICENCE公司。

Perkin Elmer ICP-MS Elan DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，配備40.68 MHz自激式射頻發(fā)生器、Gem Clean TM十字交叉霧化器、Ryton TM高分子惰性材料雙通道霧化室：美國Perkin Elmer公司；Lab Tech EHD36電熱消解板、消解管：北京萊伯泰科儀器公司；微量移液器：德國Eppendorf公司。

1.3 濕法消解流程

使用微量移液器精確量取5.00 mL樣品于消解管中，置于100 ℃電熱板上加熱驅(qū)趕乙醇至1 mL，冷卻至室溫后加入5 mL HNO3，室溫消解3 h，再置于85 ℃電熱板上加熱30 min，隨后150 ℃電熱板上蒸發(fā)至1 mL，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入容量瓶，用2% HNO3定容至25 mL，待測。所有消解管及其他玻璃容器使用前均在20% HNO3溶液中浸泡2～3 h，取出后用超純水沖洗2～3次，烘干后使用。

1.4 ICP-MS儀器條件

儀器預熱后經(jīng)調(diào)諧液優(yōu)化儀器參數(shù)，儀器軟件推薦校正方程外標法定量，以10 μg·L-1標準溶液Y作為內(nèi)標。以2% HNO3為介質(zhì)配置混合標準母液，再以母液為基礎分別配置0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1的不同濃度梯度混標溶液，繪制標準曲線。具體儀器條件和運行參數(shù)為：射頻功率1000 W，等離子氣流量15 L·min-1，載氣流量0.94 L·min-1，輔助器氣流量1.2 L·min-1，透鏡電壓5.5 V，霧化室溫度2 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 r·s-1，采樣流量0.8 mL·min-1，采樣深度8.0 mm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）、Duncan's多重比較分析、主成分分析（PCA）及線性判別分析（LDA）；SIMCA-P 14.1軟件對數(shù)據(jù)進行偏最小二乘判別分析（Partial Least-Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）；Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析過程的質(zhì)量保證

為保證試驗結(jié)果的可靠性，在測定實際葡萄酒樣品前對所用方法進行方法學驗證，表1顯示了該分析方法的驗證數(shù)據(jù)。R2均大于0.98，標準液濃度與吸收峰面積呈良好的線性回歸關系。酒樣RSD在2.4%～4.6%，回收率在78.7%～116.9%。該方法測定的元素回收率和RSD值符合實驗需求，儀器條件穩(wěn)定，可進行實際樣品檢測。

表1 ICP-MS方法學驗證結(jié)果Table 1 ICP-MS methodology verification results

2.2 產(chǎn)區(qū)元素差異分析

采用Duncan's多重比較，對葡萄酒樣品中28種檢測元素含量進行方差分析，結(jié)果顯示（表2），除U元素外，其余27種檢測元素的含量在不同產(chǎn)區(qū)的樣品中存在顯著性差異。表3顯示，各樣品中Mg、Al、Cu、Zn、Mn、Sr、Rb的含量相對較高，且顯示出產(chǎn)地差異，其他微量元素的含量也與產(chǎn)地具有一定的差異相關性。葡萄酒中礦質(zhì)元素含量主要來自于果實從土壤中吸收，土壤本身的元素含量不同，果實對每種元素吸收程度不同及人工施肥等都均會影響酒中元素的自然分布特征。

表2 不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中28種元素的含量Table 2 The content of 28 elements in wine from different regions（μg·L-1）

表3 LDA判別結(jié)果Table 3 LDA classification result table

2.3 化學計量學分析

2.3.1 主成分分析

主成分分析（PCA）屬于無監(jiān)督性學習，用于降低數(shù)據(jù)維度，并提取數(shù)據(jù)主要特征。以PC1和PC2為主成分做圖累計方差貢獻率達46.6 %，其中PC1和PC2分別解釋了總方差的34.2 %和12.4%。以主成分1（方差貢獻率為34.2%）和主成分2（方差貢獻率為12.4%）為橫縱坐標所做得分圖和散點圖分別如圖1和圖2所示。由散點圖可知，PC1與Li元素呈正相關，而PC2與Sr、Mg、Li、Ti、Mo呈較高程度正相關。由圖1所知，兩個主成分對5個葡萄酒產(chǎn)區(qū)具有不同解釋程度，DB產(chǎn)區(qū)的葡萄酒樣品主要分布在PC1的負半軸，并與其他4個產(chǎn)區(qū)的樣品顯示出明顯的不同，這主要是因為DB產(chǎn)區(qū)與含量相對較高的元素具有很強相關性，如Mn、Zn、Tl、Sb等。而XJ和HL產(chǎn)區(qū)的樣品相對更為聚集，它們均與PC1和PC2正半軸更相關，這與XJ和HL產(chǎn)區(qū)樣品中Li的含量較高有關。YCZ的葡萄酒樣品多與PC2的負半軸相關，其能夠與DB、HL、XJ三產(chǎn)地明顯區(qū)分，但未能與HT產(chǎn)區(qū)明顯區(qū)分，這主要是因為YCZ和HT產(chǎn)區(qū)樣品中含有種類相似和含量相近的元素有關。

圖1 主成分分析得分圖Figure 1 PCA score chart

圖2 主成分分析散點圖Figure 2 PCA scatter chart

2.3.2 葡萄酒產(chǎn)地判別分析

與PCA不同，LDA和PLS-DA均屬于有監(jiān)督的降維技術(shù)，經(jīng)訓練集訓練后的同組數(shù)據(jù)投影盡可能接近，而不同組數(shù)據(jù)盡可能分散，可以實現(xiàn)對測定樣品的分類。LDA的分類結(jié)果及判別模型分別見表3、表4，結(jié)果顯示，經(jīng)過留一法交叉驗證得到5個產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品預測結(jié)果的整體正確率為87.3%。其中，對DB產(chǎn)區(qū)的判別效果最好，產(chǎn)區(qū)分類正確率為100%。對于其他產(chǎn)區(qū)而言，采用該方法均有部分樣品被錯誤判別。該分析方法利用2個典則判別函數(shù)，即function1和function2，function1和Bi、Ni、Cd、Be、As具有絕對最大相關性，function2與Sr、Li、Mg、Ti、Cs之間具有絕對最大相關性，根據(jù)每個樣品在這兩個典則判別函數(shù)上的不同得分，繪制得分圖，結(jié)果顯示樣品之間的產(chǎn)地差異。根據(jù)LDA得分圖（圖3）顯示，DB產(chǎn)區(qū)的葡萄酒樣品能夠與其他4個產(chǎn)區(qū)進行區(qū)分，HL、XJ產(chǎn)區(qū)的樣品可以和HT、YCZ產(chǎn)區(qū)的樣品進行區(qū)分。為驗證模型準確率，將3個模型外樣品測定數(shù)據(jù)輸入模型，如圖3顯示的3個粉色點均被正確分類到相應產(chǎn)區(qū)分組中，判別準確率達100%。

表4 LDA判別模型Table 4 LDA discrimination model

圖3 LDA得分圖Figure 3 LDA score chart

利用PLS-DA建立判別模型，通常篩選差異物時以投影重要度（VIP）值為參數(shù)，其值越大，產(chǎn)生的影響越大。以205個樣品建立模型，其中VIP值大于1的元素依次是Li、Rb、Sr、Mg、Mo、Pb、Cd、Ti、Co。在X（R2X）方向可以擬合70.9%的方差，Y（R2Y）方向可以擬合56.2%的方差，Q2（預測準確率）為47.3%，R2Y＝70.9%＞50%，R2Y-Q2＝23.6%＜30%，表明方程擬合效果好，且不存在過度擬合情況。但該模型總體對產(chǎn)區(qū)判別時的預測效果不佳。為了獲得更加準確的判別效果，又分別對DB、HL、HT三個產(chǎn)區(qū)和XJ、YCZ兩個產(chǎn)區(qū)建立模型（1）和模型（2），表5顯示了兩個PLS-DA模型的判別結(jié)果，其得分圖分別為圖4A、圖4B所示，其預測準確率分別為81.1%和81.8%（見表5）。模型（1）中VIP值大于1的元素依次為Rb、Li、Sr、Mg、Ti、Bi、Cd、Ni；模型（2）中VIP值大于1的元素依次為Sr、Li、Mg、Rb、Ti、Cs、Mo、Cd、Cu、Be。通過三個模型共同篩選，得到對分組產(chǎn)生影響較大的差異元素共6個，包括兩個堿金屬Li、Rb；兩個堿土金屬Sr、Mg以及Ti、Cd元素。

表5 偏最小二乘分析判別分析模型（1）與模型（2）的判別結(jié)果Table 5 Discriminant analysis model (1) and model (2) discriminant results of PLS-DA

圖4 PLS-DA得分圖Figure 4 PLS-DA score chart

3 討論與結(jié)論

隨著我國葡萄酒質(zhì)量的不斷提升，開發(fā)和應用更快速、準確的原產(chǎn)地判別技術(shù)顯得尤為重要。本研究通過ICP-MS技術(shù)，對我國5個產(chǎn)區(qū)205款葡萄酒中的28種礦質(zhì)元素進行分析，得到各產(chǎn)區(qū)葡萄酒中各元素的分布特征。其中，所有樣品中Mg元素含量最高，并以新疆葡萄酒樣品中的含量最多（169 613.4 μg·L-1），其余地區(qū)樣品中Mg元素含量依次為賀蘭山東麓＞東北＞黃土高原＞西南高山。Mg元素主要由葡萄植株從土壤中吸收，通過直接影響葡萄植株的細胞結(jié)構(gòu)、光合作用速率及細胞內(nèi)酶活性，進而影響葡萄果實及所釀葡萄酒的品質(zhì)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，通過施加含Mg肥料可以明顯提高葡萄果實的產(chǎn)量和品質(zhì)[14]，肥料中的Mg元素被果實吸收，導致最終酒液中Mg元素含量增加。本研究中西南高山產(chǎn)區(qū)葡萄酒中Mg元素的含量最低，這很可能與該產(chǎn)區(qū)雨水較多，而Mg元素易隨水土流失有關[13]。本研究不同產(chǎn)區(qū)酒樣中Al元素（794.60～1383.80 μg·L-1）和Cu元素（169.22～203.71 μg·L-1）的含量存在一定的差異，這很可能與不同產(chǎn)區(qū)在葡萄栽培中所使用的肥料類型有關。有研究表明，在葡萄生長過程中施用無機肥會使所釀葡萄酒中Al元素的含量增加，而施用有機肥則會使Cu元素的含量增加[15]。5個產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中Zn元素的含量依次為東北＞黃土高原＞西南高山＞賀蘭山東麓＞新疆，新疆產(chǎn)區(qū)Zn含量最低，這可能是由于該產(chǎn)區(qū)的土壤存在一定的缺Zn現(xiàn)象[16]。Mn元素在東北產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中的含量最高（10 691.5 μg·L-1），約為賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)樣品中Mn含量的6倍，很可能與灌溉水源以及成土母質(zhì)影響土壤中Mn元素的含量有關[17]。Sr元素與地質(zhì)特征有關，其中87Sr是由Rb經(jīng)過一個β衰變而來的，并且這兩個元素多存在于含鉀礦物質(zhì)中[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sr元素的含量在東北產(chǎn)區(qū)、賀蘭山東麓、新疆三個產(chǎn)地與黃土高原、西南高山兩產(chǎn)地的樣品間差異顯著。而Rb元素在5個產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中的含量均差異顯著。

確定樣品原產(chǎn)地關鍵元素第一步由ANOVA完成[19]，后續(xù)還可以應用其他方法進行分類，本研究應用3種統(tǒng)計學方法對數(shù)據(jù)進行處理。PCA結(jié)果得出，新疆、賀蘭山東麓及西南高山產(chǎn)區(qū)的葡萄酒樣品與堿金屬元素（Li、Cs、Rb）的含量具有較強相關性。采用LDA模型對不同產(chǎn)區(qū)酒樣進行判別的整體準確率為87.3%，其中對東北產(chǎn)區(qū)判別效果最好，可達到100%，并重新測定3個新樣品，輸入數(shù)據(jù)驗證模型準確率為100%。采用PLS-DA模型對不同產(chǎn)區(qū)酒樣進行判別的整體準確率可達到80%以上，最終得到6種元素對產(chǎn)地差異貢獻率最大，包括兩個堿金屬Li、Rb；兩個堿土金屬Sr、Mg及Ti、Cd。綜上所述，礦質(zhì)元素分析技術(shù)與化學計量學分析相結(jié)合在我國葡萄酒產(chǎn)地的鑒別中可以發(fā)揮重要作用。