郭艷蘭，牟德生，趙連鑫，王鑫，馬宗桓，張兆銘，張利年

（1. 武威市林業(yè)科學(xué)研究院，甘肅武威 733000；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

武威市地處河西走廊東端，其獨(dú)特的地理位置和氣候條件，為釀制優(yōu)質(zhì)葡萄酒提供了絕佳的先天環(huán)境，使得武威成為全國釀酒葡萄九大產(chǎn)區(qū)之一。但武威產(chǎn)區(qū)冬季寒冷干燥，低溫凍害發(fā)生頻繁，葡萄需要下架埋土才能越冬，增加生產(chǎn)成本的同時(shí)也限制了該區(qū)域釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，探索提高葡萄抗寒能力的行之有效的措施成為當(dāng)前武威地區(qū)釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的關(guān)鍵問題。

葡萄砧木的抗寒性是其實(shí)現(xiàn)利用價(jià)值的關(guān)鍵之一，采用抗寒砧木進(jìn)行嫁接不僅能提高葡萄的抗寒能力，還可以提高樹體營養(yǎng)、改善果實(shí)品質(zhì)，對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用[1-3]。目前，有關(guān)釀酒葡萄砧木的抗寒性已開展了較多的研究，如牛鐵荃等[4]以不同葡萄砧木的實(shí)生苗葉片為研究對(duì)象，測(cè)定了相對(duì)電導(dǎo)率及相關(guān)生理生化指標(biāo)，并利用灰色關(guān)聯(lián)分析、隸屬函數(shù)、聚類分析等方法對(duì)其耐寒性開展了評(píng)價(jià)；李妍琪等[5]對(duì)葡萄砧木的4個(gè)雜交組合的親本及后代開展了抗寒性鑒定；李鵬程等[6]以8種葡萄砧木為試材，研究了低溫脅迫下的失水速率、萌芽率等，并比較了LT50與隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)結(jié)果的一致性；鐘海霞等[7]對(duì)7個(gè)葡萄砧木根系的抗寒性進(jìn)行了研究。而武威產(chǎn)區(qū)有關(guān)葡萄砧木抗寒性的綜合分析及評(píng)價(jià)較少。本文以從法國和意大利引入的6個(gè)釀酒葡萄砧木品種（系）為材料，在人工模擬低溫條件下，測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）等相關(guān)生理生化指標(biāo)，并采用隸屬函數(shù)法對(duì)其抗寒性進(jìn)行綜合分析及評(píng)價(jià)，以期篩選出抗寒性強(qiáng)的砧木品種（系），為該地區(qū)葡萄抗寒砧木的選擇及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試砧木品種（系）為SO4-762、SO4-102、CFS57-34、P40-151、101-141、1103P-113，均采自武威市民勤縣甘肅夏博嵐葡萄種植基地，2015年從法國和意大利引入。樹體5年生，栽植密度0.5 m×3 m，廠字形架式， 田間管理水平一致，植株生長良好。2020年10月冬剪時(shí)采集粗度1 cm、生長健壯的一年生成熟枝條，帶回武威市林業(yè)科學(xué)研究院恒溫庫沙藏備用。

1.2 試驗(yàn)處理

將沙藏枝條取出沖洗干凈，剪成10 cm左右小段，分別裝入自封袋中并做好標(biāo)記，置于高低溫試驗(yàn)箱（型號(hào)：LRHS-101A-LJ）中進(jìn)行低溫處理，先以4 ℃·h-1的速率緩慢降至目的溫度，保持24 h后再以相同速率升至4 ℃，取出置于4 ℃冰箱保存待測(cè)。共設(shè)置-14、-18、-22、-26、-30 ℃ 5個(gè)低溫處理，以4 ℃為對(duì)照。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

相對(duì)電導(dǎo)率：用修枝剪將低溫處理過的枝條避開芽眼剪成約1 mm厚的薄片，混合均勻后稱取1 g置于25 mL試管中，加入20 mL蒸餾水，加蓋于室溫靜置4 h，用DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀測(cè)定初始電導(dǎo)率，測(cè)前搖勻；于沸水中煮30 min，冷卻至室溫后測(cè)定終電導(dǎo)率，計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率（相對(duì)電導(dǎo)率＝初始電導(dǎo)率/終電導(dǎo)率×100%）和低溫半致死溫度（LT50）[8]，并進(jìn)行曲線擬合，擬合方程如下：

其中，Y代表相對(duì)電導(dǎo)率，a、b為方程參數(shù)，K為常數(shù)，代表最大電解質(zhì)滲出率，由于Y是累積頻率，此處K取100，LT50即方程拐點(diǎn)，計(jì)算方式為：

生理生化指標(biāo)：將各處理枝條剪成2～3 mm薄片，用液氮冷凍后迅速將枝條粉碎，置于-80℃冰箱保存用于測(cè)定生理生化指標(biāo)。MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及過氧化氫酶（CAT）活性均采用武漢純度生物酶聯(lián)免疫分析試劑盒（ELISA）進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Office進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖、SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

抗寒性的綜合分析與評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)法[9-10]進(jìn)行，計(jì)算公式如下：

式中，U(Xij)為測(cè)定i品種j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值，Xij為i品種j指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmin為j指標(biāo)的最小值，Xjmax為j指標(biāo)的最大值，i表示品種，j表示抗寒指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對(duì)葡萄砧木枝條相對(duì)電導(dǎo)率的影響

低溫處理后各砧木品種（系）的相對(duì)電導(dǎo)率變化如圖1所示，隨著溫度的降低，各砧木枝條的相對(duì)電導(dǎo)率均呈上升趨勢(shì)，且升高趨勢(shì)各有不同。在-18～4 ℃時(shí)，各品種（系）相對(duì)電導(dǎo)率隨處理溫度的降低表現(xiàn)緩慢上升，其中，101-141上升幅度最小，1103P-113次之，P40-151上升幅度最大；隨著溫度的繼續(xù)降低，各品種（系）的相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度增加，-22 ℃時(shí)變化最為明顯；-30～-26 ℃溫度處理時(shí)，各品種（系）相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度降低繼續(xù)升高但幅度變緩；在低溫處理過程中，P40-151的相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度降低的增幅最大，CFS57-34的相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度降低的增幅最小，且-30 ℃溫度處理后，101-141的相對(duì)電導(dǎo)率最大，P40-151次之，而CFS57-34的相對(duì)電導(dǎo)率最小。

圖1 低溫處理下不同砧木品種枝條的相對(duì)電導(dǎo)率Figure 1 Relative conductivity in branches of different rootstock under low temperature treatments

2.2 Logistic模型建立及低溫半致死溫度

根據(jù)試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)各砧木的相對(duì)電導(dǎo)率建立Logistic方程，并根據(jù)方程計(jì)算半致死溫度LT50，如表1所示。各砧木Logistic方程擬合度R2在0.7272～0.8961，表明所擬合方程具有較高的可靠性，由此計(jì)算的LT50真實(shí)可用。各砧木的LT50在-25.86～-21.85℃，LT50值越小，說明抗寒性越強(qiáng)。

表1 低溫處理下不同砧木品種枝條的低溫半致死溫度和擬合方程Table 1 LT50 and fitting equation in branches of different rootstock varieties under low temperature treatments

2.3 低溫處理對(duì)葡萄砧木枝條生理指標(biāo)的影響

2.3.1 低溫處理對(duì)MDA的影響

低溫處理后各砧木品種（系）枝條的MDA含量變化如圖 2所示，隨著溫度的降低，各砧木枝條的MDA含量均呈上升趨勢(shì)。-30～4 ℃低溫處理過程中，P40-151枝條MDA含量升高幅度最快，而CFS57-34枝條MDA含量升高幅度最慢，其余4個(gè)品種（系）枝條的MDA含量變化介于二者之間；-30 ℃低溫處理后，P40-151枝條的MDA含量顯著高于其他品種（系），而CFS57-34枝條的MDA含量顯著低于其他品種（系）。

圖2 低溫處理下不同砧木品種枝條的MDA含量Figure 2 MDA content in branches of different rootstock under low temperature treatments

2.3.2 低溫處理對(duì)游離脯氨酸影響

如圖3所示，隨著溫度的降低，各砧木品種（系）枝條的游離脯氨酸含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但變化幅度各不相同。4 ℃時(shí)1103P-113枝條的游離脯氨酸含量最高，而SO4-762枝條的游離脯氨酸含量最低；當(dāng)處理溫度降至-22 ℃，101-141、CFS57-34枝條的游離脯氨酸急劇升高且達(dá)到最高，而其余各品種（系）枝條的游離脯氨酸隨著溫度的繼續(xù)降低持續(xù)增加，至-26 ℃時(shí)，SO4-762、SO4-102、P40-151、1103P-113枝條的游離脯氨酸含量達(dá)到最高，后隨溫度的繼續(xù)降低，各砧木的游離脯氨酸含量持續(xù)降低。低溫處理過程中，101-141、CFS57-34枝條游離脯氨酸含量隨溫度降低的增幅較大，SO4-102、P40-151枝條游離脯氨酸含量隨溫度降低的增幅較小。

圖3 低溫處理下不同砧木品種枝條的游離脯氨酸Figure 3 Freee proline content in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.3.3 低溫處理對(duì)可溶性糖的影響

由圖4可知，不同砧木枝條的可溶性糖含量隨著處理溫度的降低持續(xù)增加。4 ℃時(shí)CFS57-34枝條的可溶性糖含量最低，其次為1103P-113，而P40-151枝條的可溶性糖含量最高。隨著處理溫度的不斷降低，各砧木枝條可溶性糖含量快速升高，至-30 ℃時(shí)達(dá)到最高水平，且CFS57-34枝條的可溶性糖含量最高，且顯著高于其他砧木品種（系），101-141枝條的可溶性糖含量最低，但與其余4個(gè)品種（系）無明顯差異。

圖4 低溫處理下不同砧木品種枝條的可溶性糖含量Figure 4 Soluble sugar content in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.3.4 低溫處理對(duì)可溶性蛋白的影響

由圖5所示，各品種（系）枝條的可溶性蛋白含量隨溫度降低逐漸升高。4 ℃時(shí)，CFS57-34枝條的可溶性蛋白含量最高，其次為SO4-762，而SO4-102的可溶性蛋白含量最低，且顯著低于其余各品種（系）。隨著溫度的降低，各品種（系）枝條的可溶性蛋白含量出現(xiàn)不同程度的增加，至-30 ℃時(shí)增至最高，其中，1103P-113的可溶性蛋白含量最高，其次為CFS57-34，二者無明顯差異，P40-151的可溶性蛋白含量最低。

圖5 低溫處理下不同砧木品種枝條的可溶性蛋白Figure 5 Soluble protein content in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.3.5 低溫處理對(duì)CAT活性的影響

由圖6可以看出，不同砧木枝條的CAT活性隨溫度的變化不同。SO4-102和P40-151枝條的CAT活性隨溫度降低先升高后下降。在-22 ℃時(shí)升至最高水平，而后隨著溫度的繼續(xù)降低出現(xiàn)下降；其余4個(gè)品種枝條的CAT活性隨溫度降低持續(xù)上升，至-30 ℃時(shí)達(dá)到最高，且1103P-113、CFS57-34的CAT活性顯著高于其他品種，而P40-151的CAT活性最低。

圖6 低溫處理下不同砧木品種枝條的CAT活性Figure 6 CAT activity in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.4 不同砧木品種抗寒性分析

采用隸屬函數(shù)法對(duì)6個(gè)葡萄砧木品種（系）枝條的相對(duì)電導(dǎo)率及各抗寒相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析及評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。根據(jù)抗寒指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值大小可知，各砧木品種的（系）抗寒性由強(qiáng)到弱依次為：CFS57-34＞1103P-113＞101-141＞SO4-762＞SO4-102＞P40-151。

表2 不同砧木品種各抗寒指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 2 Subordination value of cold resistance indexs of different rootstock varieties

3 討論與結(jié)論

低溫會(huì)破壞植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)離子、糖類等物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)外滲，從而導(dǎo)致電解質(zhì)的升高[11]。細(xì)胞電解質(zhì)的外滲程度可用相對(duì)電導(dǎo)率來表示，且相對(duì)電導(dǎo)率越高，表明細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲越多，細(xì)胞膜的透性越大，也說明植株細(xì)胞膜受到傷害的程度越大，抗寒能力越弱[12]。目前，利用相對(duì)電導(dǎo)率法對(duì)果樹抗寒性進(jìn)行研究已得到了廣泛應(yīng)用[13-17]。本文測(cè)定結(jié)果顯示，各砧木枝條的相對(duì)電導(dǎo)率均隨溫度的降低而升高，且相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度降低的增幅越多，抗寒性越弱，反之抗寒性越強(qiáng)。這與前人研究結(jié)果一致[18-20]。根據(jù)Logistic方程預(yù)測(cè)得出6個(gè)葡萄砧木品種（系）枝條的半致死溫度在-25.86～-21.85℃，部分品種的低溫半致死溫度與劉鈺璽等[18]的研究結(jié)果有一定差異，這主要與枝條的低溫處理方式、相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定方法等因素有關(guān)。

植物的生理生化指標(biāo)與其抗寒性有著密切聯(lián)系[21]。植物在受到低溫脅迫時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的生理生化過程來誘導(dǎo)自身細(xì)胞代謝向著適應(yīng)低溫的方向發(fā)展，從而提高抗寒能力[19]。MDA是膜脂過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，是植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受害的重要標(biāo)志之一，其含量的增加與植物的受害程度有極顯著的相關(guān)性[22-23]。研究結(jié)果表明，隨著溫度的降低，各品種（系）砧木枝條的MDA含量均逐漸升高，其中，P40-151枝條MDA含量增幅最快且最終維持在較高水平，而CFS57-34枝條MDA含量增幅最慢且維持在較低水平，這與相對(duì)電導(dǎo)率變化一致，也進(jìn)一步證實(shí)了MDA變化與其抗寒性的關(guān)系[24-25]。

游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物的抗寒性密切相關(guān)。游離脯氨酸的積累可以提高植物體內(nèi)滲透壓，增強(qiáng)保水力，提高植物的抗寒性[26]；可溶性糖含量的增加可使植物細(xì)胞液濃度升高，降低冰點(diǎn)溫度，可溶性蛋白具有較高的親水性，其含量與可溶性糖含量密切相關(guān)，因此常被作為植物抗寒性鑒定的重要指標(biāo)[27-28]。本研究中，各品種（系）砧木枝條的游離脯氨酸含量隨溫度的降低先上升后下降，可溶性糖含量和可溶性蛋白含量隨溫度的降低而升高，且抗寒性較強(qiáng)的品種其脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量隨溫度的降低升高較快，并且最終保持在較高水平，而抗寒性較弱的品種則正好相反，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的升高較慢且水平較低。這與施明[12]、鐘海霞[29]、付曉偉[30]等的研究結(jié)果基本一致，說明在遭受低溫脅迫時(shí)，葡萄枝條可以通過代謝增加體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以此來保護(hù)機(jī)體免受低溫傷害。

CAT是植物體內(nèi)的活性氧化保護(hù)酶之一，低溫環(huán)境下，它可以通過自身的調(diào)控來保護(hù)植株，以減輕植物的低溫?fù)p傷。在本研究中，SO4-102和P40-151枝條的CAT活性隨溫度降低先升高后下降，而其余品種枝條的CAT活性隨溫度降低持續(xù)上升，表明在一定的低溫范圍內(nèi)，葡萄枝條可以通過提高氧化防御酶活性來增強(qiáng)自身的耐寒能力，但當(dāng)?shù)蜏爻隽嗽撈贩N的耐受范圍時(shí)，細(xì)胞膜受到損害，酶活降低，這主要與砧木品種（系）的抗寒能力強(qiáng)弱有關(guān)[31-32]。

與植物抗寒性相關(guān)的指標(biāo)有很多，單一的某個(gè)指標(biāo)具有片面性，在植物抗寒性研究中，通常需要對(duì)多個(gè)抗寒指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，以此來判斷其抗寒性[33,31,29]。本文采用隸屬函數(shù)法對(duì)6個(gè)砧木品種（系）的抗寒性進(jìn)行了綜合分析，得出各品種（系）的抗寒性強(qiáng)弱順序?yàn)镃FS57-34＞1103P-113＞101-141＞SO4-762＞SO4-102＞P40-151，這與預(yù)測(cè)得出的各砧木品種（系）的LT50排序略有差異，可能與LT50為單一指標(biāo)有關(guān)。

綜合以上表明，法國和意大利引入武威地區(qū)的6個(gè)釀酒葡萄砧木品種（系）中，CFS57-34的抗寒性最強(qiáng)，1103P-113、101-141、SO4-762、SO4-102的抗寒性較強(qiáng)，P40-151的抗寒性最弱。