周佳欣，鄒文進(jìn)

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧 530021）

角膜瘢痕是導(dǎo)致失明的主要原因[1-2]，多種眼科常見(jiàn)病均可能導(dǎo)致角膜瘢痕，包括角膜堿燒傷、感染、炎癥、內(nèi)眼手術(shù)等[3]，一旦角膜愈合過(guò)程形成永久性瘢痕，將會(huì)影響視力，患者可能需要進(jìn)行角膜移植，但現(xiàn)在角膜供體非常緊缺，亟待一種可以抑制角膜瘢痕形成的藥物。多西環(huán)素是一種常用的抗生素，具有良好的抗炎和抗感染作用[4]，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，其還可以抑制肺纖維化[5]、心肌纖維化[6]、減輕皮膚瘢痕厚度[7]等，然而其是否可以抑制角膜瘢痕形成鮮有報(bào)道，其如何對(duì)瘢痕相關(guān)因子的產(chǎn)生作用更是尚未闡明。角膜瘢痕形成是涉及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子合成與分泌，上皮細(xì)胞再生，角膜細(xì)胞纖維化增生的復(fù)雜過(guò)程[8]；其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）誘導(dǎo)的角膜細(xì)胞纖維化是重要因素。本研究通過(guò)TGF-β1 誘導(dǎo)角膜細(xì)胞分化成角膜肌成纖維細(xì)胞，觀察多西環(huán)素對(duì)體外培養(yǎng)的角膜肌成纖維細(xì)胞Collagen Ⅰ和Fibronectin表達(dá)的抑制作用，并用大鼠構(gòu)建角膜堿燒傷模型，觀察多西環(huán)素對(duì)堿燒傷后形成的角膜瘢痕作用，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抑制角膜瘢痕形成，并探索其深入的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清、青霉素—鏈霉素雙抗（加拿大WISENT 公司）；0.05%胰酶（美國(guó)Sciencell 公司）；Ⅰ型膠原酶（美國(guó)Gibco 公司）；人重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1（美國(guó)Peprotech 公司）；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder 公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)試劑盒（日本Takara 公司）；重組Anti-Vimentin 抗體、重組Anti-Keratin12 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；羊抗兔IgG H&L、羊抗鼠IgG H &L（英國(guó)Abcam 公司）；DAPI、抗熒光淬滅的封片液（中國(guó)索萊寶公司）；各種規(guī)格移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf 公司）；多西環(huán)素粉末（美國(guó)Sigma 公司）；顯微鏡和熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 人角膜原代細(xì)胞的分離 收集飛秒激光微小切口基質(zhì)透鏡取出術(shù)（SMILE 術(shù)）中取出的角膜基質(zhì)，放入裝有無(wú)菌DMEM/F12 培養(yǎng)基的試管中，4 ℃低溫運(yùn)輸，4 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至無(wú)菌工作臺(tái)；用含有100 μL/mL 青霉素/鏈霉素的PBS 反復(fù)漂洗3 次，然后用眼科剪剪成小塊后放入Ⅰ型膠原酶溶液，放置37 ℃環(huán)境中消化1 h；充分消化后，用200 目細(xì)胞過(guò)濾篩過(guò)濾溶液后，1 000 r/min 離心5 min，小心去除上清，然后往裝有細(xì)胞沉淀的試管中加入適量的DMEM/F12 培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清），混勻后計(jì)數(shù)種瓶，放入37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)。

1.3 人角膜細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和鑒定 用倒置顯微鏡觀察，原代細(xì)胞融合度達(dá)85%進(jìn)行細(xì)胞傳代，培養(yǎng)基改為DMEM/F12 培養(yǎng)基（含有5%胎牛血清），每2 d換液1次，如融合度到85%即進(jìn)行傳代。傳到第3 代以后，隨機(jī)抽取3 瓶將細(xì)胞種到12 孔板，1×104個(gè)/孔，當(dāng)孔板內(nèi)細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)，用PBS輕柔漂洗3次，每次5 min；加入1 mL孔4%多聚甲醛固定15 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；加入200 μL 孔0.1%tritonX 100 通透15 min；PBS 漂洗3 次后，加入500 μL/孔BSA 封閉30 min；小心吸去封閉液后，加入Anti-keratin（1∶50）和Anti-Vimentin（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜；第2天棄一抗，用PBS漂洗3 次；吸干PBS 加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗，羊抗兔IgG H&L（1∶2 000）和羊抗鼠IgG H&L（1∶3 000），避光孵育1 h，棄二抗后用PBS漂洗3次，加入DAPI避光孵育5 min，用PBS漂洗3次后加入抗熒光淬滅的封片液封片到熒光倒置顯微鏡觀察并采集結(jié)果。

1.4 人角膜細(xì)胞纖維化模型制備和分組 將細(xì)胞分為3 組，對(duì)照組：正常細(xì)胞，不加入任何生長(zhǎng)因子和藥物；模型組：在細(xì)胞傳代種瓶后，隨即加入5 ng/mL TGF-β1；多西環(huán)素組：細(xì)胞傳代并加入5 ng/mL TGF-β1 干預(yù)后2 h，往培養(yǎng)瓶中加入20 ng/mL 的多西環(huán)素溶液（以PBS 為溶液）。將各組細(xì)胞放置37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)CollagenⅠ和Fibronectin mRNA表達(dá)水平 根據(jù)Takara 抽提總RNA 試劑盒9767 說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA；使用Nano drop 檢測(cè)所提取到的RNA 質(zhì)量，A260/A280 為1.8～2.0 之間，符合實(shí)驗(yàn)要求，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s預(yù)變性；95 ℃3 s，60 ℃34 s，設(shè)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列為：GAPDH：上游5’-AGATCCCTCCAAAATCAA-GTGG-3，下游5’-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3’；CollagenⅠ引物：上游5’-TTCTGCAACATGGAGACTGG-3’，下游5’-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3’；Fibronectin 引 物：上 游5’-ACTGAGACTCCGAGTCAGCC-3’；下游5’-TTCCAACGGCCTACAGAATT-3’。目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.6 Western blotting 檢測(cè)CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表達(dá)水平 用含有PMSF的RIPA裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h，分別使用相應(yīng)的一抗Tubulin（1∶3 000），F(xiàn)ibronectin（1∶1 000）和Collagen I（1∶1 000）孵育過(guò)夜，二抗（Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody，1∶2 000）孵育1 h，使用ECL 法進(jìn)行顯影。用Image J 測(cè)量條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組 本研究選用180～220 g 健康雌性SD 大鼠，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物室條件下[溫度：（24±1）℃；濕度：（50±5）%]，適應(yīng)1 周。造模前，使用體視顯微鏡檢查眼部情況，排除有眼前段疾病的大鼠；采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組和多西環(huán)素組，每組18 只。模型制備：對(duì)大鼠左眼進(jìn)行角膜堿燒傷造模，遵循以下步驟：首先，用異氟烷全身麻醉，鹽酸丙美卡因滴眼液滴左眼表麻，然后用移液槍吸取2 μL 1 mol/L NaOH 溶液，滴到直徑為2 mm 的濾紙上，將該濾紙放置在角膜中央60 s，造成Ⅲ級(jí)堿燒傷,最后使用足量生理鹽水徹底沖洗干凈眼表。沖洗完成后，可見(jiàn)角膜中央形成一圓形灰白色燒灼斑，呈磨玻璃狀，角膜基質(zhì)水腫，虹膜隱約可見(jiàn)。造模成功后，給予眼液滴眼，對(duì)照組用眼液溶媒（除不含多西環(huán)素，其余一樣），多西環(huán)素組用3 000 ng/mL 多西環(huán)素眼液，每天滴眼4 次，直至觀察期末。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例。

1.8 大鼠角膜混濁度評(píng)分

大鼠造模成功后，每天給予眼藥水滴眼時(shí)，觀察角膜恢復(fù)情況，并于第3、第7、第14 天在體視顯微鏡下仔細(xì)觀察眼前段情況，對(duì)角膜混濁度評(píng)分并采集照片，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Holland 等[9]的標(biāo)準(zhǔn)：0 分：角膜透明無(wú)混濁；1 分：角膜輕度混濁,虹膜紋理可見(jiàn)；2分：角膜混濁較重,虹膜紋理不清；3分：角膜混濁進(jìn)一步加重,但可見(jiàn)瞳孔；4分：角膜完全混濁,看不清瞳孔。

1.9 蘇木精—伊紅（HE）染色觀察大鼠角膜結(jié)構(gòu)變化

大鼠造模成功后，在第3、第7、第14 天隨機(jī)處死大鼠，取下眼球，清洗干凈后，放入4%多聚甲醛中固定，依次梯度酒精進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片，烤片，HE 染色，中性樹(shù)膠封片光學(xué)顯微鏡觀察，選取目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行拍照，分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人角膜原代細(xì)胞鑒定

免疫熒光結(jié)果可見(jiàn)Vimentin（綠色熒光）、DAPI（藍(lán)色熒光），未見(jiàn)Keratin（紅色熒光），確定為角膜細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

圖1 角膜細(xì)胞Vimentin和Keratin表達(dá)情況（免疫熒光，×100）

2.2 多西環(huán)素對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的人角膜細(xì)胞纖維化抑制作用

與對(duì)照組比較，模型組Fibronectin、Collagen ImRNA及其蛋白表達(dá)均增高（P＜0.05）；與模型組比較，多西環(huán)素組Fibronectin、Collagen ImRNA 及其蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組Fibronectin和CollagenⅠ的mRNA及其蛋白表達(dá)情況

2.3 多西環(huán)素對(duì)大鼠角膜混濁度影響

角膜堿燒傷后第3天，兩組大鼠虹膜紋理不清，瞳孔隱約可見(jiàn)，基質(zhì)水腫，結(jié)膜充血，上皮缺損；第7天，兩組大鼠角膜基質(zhì)水腫均消退，對(duì)照組瞳孔不可見(jiàn)，周邊有大量新生血管長(zhǎng)入，多西環(huán)素組瞳孔可見(jiàn)，虹膜紋理不清，未見(jiàn)明顯新生血管長(zhǎng)入；第14天，對(duì)照組瞳孔隱約可見(jiàn)，虹膜紋理不清，周邊新生血管長(zhǎng)入，多西環(huán)素組，除了角膜右下方還有約1 mm×1 mm 大小的角膜斑翳外，整個(gè)角膜透亮，瞳孔、虹膜清晰可見(jiàn)，周邊新生血管少，見(jiàn)圖3。角膜堿燒傷后第7、第14 天多西環(huán)素組角膜混濁度評(píng)分均低于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜混濁度評(píng)分±s

表1 大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜混濁度評(píng)分±s

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖3 大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜情況

2.4 HE染色觀察大鼠角膜結(jié)構(gòu)變化

角膜堿燒傷后第3 天，可見(jiàn)兩組角膜上皮均有明顯缺損，基質(zhì)層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，接近上皮層處可見(jiàn)新生血管管腔。此外，對(duì)照組角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)較為紊亂；第7 天，兩組上皮均開(kāi)始重新生長(zhǎng)，基質(zhì)層炎癥細(xì)胞和新生血管減少，而對(duì)照組上皮與基質(zhì)連接疏松，基質(zhì)結(jié)構(gòu)依然十分紊亂，炎癥細(xì)胞比多西環(huán)素組更多；第14天，兩組角膜上皮修復(fù)，視野內(nèi)無(wú)明顯可見(jiàn)炎癥細(xì)胞，對(duì)照組基質(zhì)結(jié)構(gòu)排列比多西環(huán)素組紊亂，見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)HE染色圖（×200）

3 討論

眼化學(xué)性燒傷發(fā)生率占眼外傷的11.5%～22.1%，是造成角膜瘢痕的重要原因，而且堿性燒傷因堿能溶解脂肪和蛋白，滲入眼內(nèi)，會(huì)造成眼內(nèi)組織壞死[10-11]，后果非常嚴(yán)重。目前研究認(rèn)為，異常的愈合反應(yīng)將會(huì)誘發(fā)炎癥因子和細(xì)胞因子變化，發(fā)生一系列異常的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起角膜細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞[12]、晶狀體蛋白生成減少、細(xì)胞外基質(zhì)排列紊亂[13]，最終形成角膜瘢痕。本研究在大鼠角膜堿燒傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，堿燒傷3天后，兩組大鼠均角膜上皮缺損，結(jié)膜充血，HE染色可見(jiàn)角膜基質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原排列紊亂；堿燒傷7天后，多西環(huán)素組炎癥細(xì)胞少于對(duì)照組，并且膠原排列比對(duì)照組整齊，提示多西環(huán)素可減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)紊亂；堿燒傷14 天后，多西環(huán)素組角膜整體透明度比對(duì)照組高，僅可見(jiàn)少量斑翳，表明多西環(huán)素可以減輕角膜堿燒傷后角膜混濁度。

角膜損傷以后TGF-β1 合成增加會(huì)誘導(dǎo)角膜細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)它增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，是導(dǎo)致角膜纖維化的重要原因[14-16]，F(xiàn)ibronectin和Collagen I是角膜纖維化的重要基因和細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分[17-18]。因此，本研究在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入TGF-β1 構(gòu)建角膜瘢痕形成的體外模型；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1能高效誘導(dǎo)Fibronectin和Collagen I表達(dá)，而多西環(huán)素可以下調(diào)Fibronectin和Collagen的表達(dá)。多西環(huán)素雖然目前作為抗生素使用，但研究發(fā)現(xiàn)它具有良好的抗炎作用，且能抑制細(xì)胞外基質(zhì)的異常合成，重塑細(xì)胞外基質(zhì)[19-21]。故推測(cè)多西環(huán)素通過(guò)抑制Fibronectin 異常增殖和CollagenⅠ異常沉積，恢復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)；減輕大鼠角膜堿燒傷后炎癥反應(yīng)，使膠原恢復(fù)正常排列，從而減輕角膜瘢痕。

綜上所述，多西環(huán)素可以抑制人角膜細(xì)胞纖維化基因的表達(dá)，減輕大鼠角膜堿燒傷后角膜的混濁度，促進(jìn)角膜上皮修復(fù)。本研究結(jié)果為多西環(huán)素用于臨床治療角膜堿燒傷提供了一定的理論基礎(chǔ)和運(yùn)用依據(jù)。