馮 豆，張 洪，范月瑩，宋 玲，譚佳杰

(武漢大學(xué)a.人民醫(yī)院藥學(xué)部； b.研究生院2019級(jí)，武漢 430060)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是21世紀(jì)最為常見(jiàn)的高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的生命[1]。目前臨床上HCC的治療策略以手術(shù)切除、射頻消融、介入、靶向和免疫治療的多學(xué)科綜合治療為主[2]，雖然一定程度可以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但由于HCC病程復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因及多條信號(hào)通路的改變，遷移和侵襲性強(qiáng)，導(dǎo)致大多數(shù)患者的預(yù)后效果仍然不佳。因此發(fā)現(xiàn)新的HCC治療靶點(diǎn)，制定更有效的治療策略，仍是目前亟待解決的問(wèn)題。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性的小非編碼RNA，長(zhǎng)度約21～23個(gè)核苷酸。目前miRNAs已被證實(shí)是參與基因表達(dá)調(diào)控的一類重要分子，miRNAs調(diào)控失常后可以直接或間接地調(diào)節(jié)原癌基因或抑癌基因的表達(dá)水平，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲、血管生成等行為，參與肝癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)程[3]。miR-3200-3p是發(fā)現(xiàn)較晚的一種miRNA，目前有關(guān)miR-3200-3p的研究較少，但已有研究[4-5]表明miR-3200-3p在胃癌、乳腺癌等腫瘤中能發(fā)揮抑癌因子作用。然而，miR-3200-3p在HCC中的作用尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探索miR-3200-3p對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，并對(duì)其可能的分子機(jī)制展開(kāi)探索，希望為HCC的臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系Bel-7402(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司)；人正常肝細(xì)胞HL-7702(武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科惠贈(zèng))；293T細(xì)胞和大腸桿菌菌株DH5α(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和青-鏈霉素溶液(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；限制性內(nèi)切酶(美國(guó)New England Biolabs公司)；Taq Plus DNA聚合酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；T4 DNA連接酶(美國(guó)Thermo Scientific公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中量試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(日本TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；4%多聚甲醛溶液(武漢賽維爾生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；核蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；GADPH抗體、β-catenin抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)抗體、E-cadherin抗體及二抗anti-rabbit IgG(H+L)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)miR-3200-3p的表達(dá)

用胰酶消化生長(zhǎng)狀態(tài)較好的HL-7702和Bel-7402細(xì)胞，分別接種于6孔板，使其48 h后細(xì)胞密度達(dá)80%以上。采用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度。采用RT-qPCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，39個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-3200-3p的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：U6-上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;U6-下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-3200-3p-上游:5′-ACACTCCAGCTGGGCACCTTGCGCTACTCA-3′;miR-3200-3p-下游:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.2.2 miR-3200-3p低表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/index.shtml)獲得miR-3200-3p的成熟體序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件根據(jù)其反義序列設(shè)計(jì)并合成單鏈引物(引物上游:5′-AATTCAAAAACACCTTGCGCTACTCAGGTCTG-3′;引物下游:5′-CcggCAGACCTGAGTAGCGCAAGGTG TTTTTg-3′)，將引物置于90 ℃水浴15 min，然后使其冷卻至室溫進(jìn)行退火，從而形成雙鏈DNA。利用T4 DNA ligase將Age I、EcoR I雙酶切線性化的hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin載體和退火雙鏈DNA于16 ℃連接1～3 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取一定量的菌液進(jìn)行測(cè)序，并將結(jié)果與已知目的基因的序列對(duì)比分析。

1.2.3 慢病毒載體的包裝及純化

采用天根無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒抽提目的基因載體質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0。待293T細(xì)胞的匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，在一無(wú)菌1.5 mL離心管中分別加入20 μg GV280、15 μg pHelper 1.0、10 μg pHelper 2.0載體質(zhì)粒及相應(yīng)體積的轉(zhuǎn)染試劑，混勻后于室溫靜置15 min。隨后將上述混合液緩慢滴加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后棄掉轉(zhuǎn)染液，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后收集細(xì)胞上清液，4 ℃、4000 r·min-1離心10 min；隨后用0.45 μm濾器對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的液體于4 ℃、25 000 r·min-1離心2 h。離心結(jié)束后，棄上清，加入病毒保存液，輕輕吹打使其重懸；10 000 r·min-1離心5 min，取上清進(jìn)行分裝并保存于-80 ℃，即完成病毒載體的濃縮及純化。

1.2.4 miR-3200-3p穩(wěn)定低表達(dá)肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建

根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒質(zhì)粒的不同將Bel-7402細(xì)胞分為2組：LV-control組及LV-inhibitor。待所有細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)病毒滴度計(jì)算出所需加入的病毒量，按照MOI=20配制感染液，于37 ℃感染12～16 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，判斷其感染效率，確認(rèn)慢病毒是否成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含2 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基中，每2 d更換培養(yǎng)液，直至未轉(zhuǎn)染成功的Bel-7402細(xì)胞全部被殺死。采用RT-qPCR法檢測(cè)2組肝癌細(xì)胞中miR-3200-3p的相對(duì)表達(dá)水平，驗(yàn)證其敲低效果。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力

采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。遷移實(shí)驗(yàn)用不含血清的培養(yǎng)基，以 1×105細(xì)胞·孔-1密度將細(xì)胞接種于Transwell上室，下室則加500 μL提前配好的含20%FBS的1640培養(yǎng)基，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去上室及下室中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，置于1 mL 的4%多聚甲醛溶液中固定30 min，用PBS輕輕潤(rùn)洗；然后置于1 mL的0.1%結(jié)晶紫溶液中染色15 min，用PBS潤(rùn)洗多次直到紫色褪去，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)膜上的細(xì)胞，留下遷移到膜背面的細(xì)胞、晾干，于倒置顯微鏡觀察并拍照。侵襲實(shí)驗(yàn)則將BD Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基以1:8的比例稀釋，50 μL·孔-1均勻添加到上室于37 ℃條件下孵育4～5 h待其凝固。然后以2×105細(xì)胞·孔-1密度將細(xì)胞接種于Transwell上室，其他條件同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)

分別將2組細(xì)胞以2×105細(xì)胞·孔-1接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)85%以上時(shí)收集細(xì)胞。于冰上加入RIPA裂解液裂解30 min，然后4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min，轉(zhuǎn)移上清，即得到細(xì)胞總蛋白；用核蛋白提取試劑盒分別抽提出核蛋白和漿蛋白。配置12%的SDS-PAGE分離膠和4%的SDS-PAGE濃縮膠，每孔加20 μg蛋白，80 V恒壓電泳1 h，隨后120 V恒壓電泳1 h至溴酚藍(lán)跑出膠底；恒流200 mA電轉(zhuǎn)2 h，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%BSA封閉2 h，然后于4 ℃分別過(guò)夜孵育GADPH抗體(1:1000)、β-catenin抗體(1:1000)、MMP2抗體(1:1000)和E-cadherin抗體(1:1000)；接著孵育二抗2 h(1:10 000)；最后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描并分析其灰度值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞系中miR-3200-3p的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞HL-7702比較，肝癌細(xì)胞Bel-7402中miR-3200-3p的相對(duì)表達(dá)量更高(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

*P<0.001與HL-7702細(xì)胞比較。圖1 各細(xì)胞系中miR-3200-3p的相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 miR-3200-3p穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系的鑒定

2.2.1 基因測(cè)序

重組載體質(zhì)粒miR-3200-3p-inhibitor基因測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒與目的基因的反義序列相符,且均為單峰,提示重組載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒載體基因測(cè)序圖譜

2.2.2 慢病毒重組載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡觀察顯示2組的感染效率均為95%以上(圖3A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與LV-control 組比較，LV-inhibitor組細(xì)胞中miR-3200-3p的表達(dá)顯著降低，抑制效率達(dá)到80%以上(P<0.001)，見(jiàn)圖3B。

A：倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；B：RT-qPCR檢測(cè)miR-3200-3p的表達(dá)水平。*P<0.001與LV-control組比較。

2.3 各組肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力比較

Transwell結(jié)果顯示，敲低miR-3200-3p的表達(dá)后，Bel-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著降低(P<0.001)。見(jiàn)圖4。

2.4 各組肝癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的比較

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲低miR-3200-3p的表達(dá)后總β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，胞漿和胞核中的β-catenin蛋白表達(dá)亦均顯著降低(P<0.001)。此外，抑制miR-3200-3p的表達(dá)后，遷移及侵襲相關(guān)蛋白MMP2的表達(dá)顯著降低(P<0.001)，而E-cadherin的表達(dá)顯著上升(P<0.001)。見(jiàn)圖5。

A：細(xì)胞遷移能力比較。*P<0.001與LV-control組比較。圖4 2組肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的比較

B：細(xì)胞侵襲能力比較。*P<0.001與LV-control組比較。圖4(續(xù))

A：Western blot圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較。*P<0.05，***P<0.001與LV-control組比較。

3 討論

近年研究[6-9]表明miRNAs的異常表達(dá)參與了細(xì)胞分化、炎癥、生長(zhǎng)和癌變等多種生命過(guò)程的調(diào)節(jié)，其中在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程的研究最為廣泛和深入，是潛在的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。miR-3200是由位于22號(hào)染色體上的miR-3200基因編碼的一類miRNA，含有miR-3200-3p和miR-3200-5p兩個(gè)成熟體。目前國(guó)內(nèi)外的研究多集中在miR-3200-5p上，對(duì)miR-3200-3p的研究較少。最近有研究[4-5]顯示miR-3200-3p與惡性腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，如國(guó)內(nèi)學(xué)者WANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞NCI-N87中，敲低LncRNA PEG10的表達(dá)可以通過(guò)上調(diào)miR-3200-3p的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，提示miR-3200-3p在胃癌細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌作用。在對(duì)晚期乳腺癌患者的研究中，AL KHANBASHI等[5]發(fā)現(xiàn)在新輔助化療期間患者血清的miR-3200-3p水平下降，且血清miR-3200-3p水平與乳腺癌殘留和復(fù)發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，提示miR-3200-3p可能是乳腺癌的抑制標(biāo)志物，但其作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索。本研究對(duì)miR-3200-3p在HCC中的作用進(jìn)行研究，檢測(cè)了人肝癌細(xì)胞系Bel-7402和正常肝細(xì)胞系HL-7702中miR-3200-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中miR-3200-3p的表達(dá)顯著升高；同時(shí)體外敲減miR-3200-3p后可抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，提示其在HCC中發(fā)揮促癌作用。

腫瘤細(xì)胞的高遷移、高侵襲能力是引起患者預(yù)后效果差、死亡率高的重要原因，但其具體的機(jī)制十分復(fù)雜。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是與腫瘤遷移和侵襲密切相關(guān)的通路之一，β-catenin是該通路最為關(guān)鍵的蛋白。在缺乏Wnt配體時(shí)，β-catenin被由APC、GSK3β、CK1α(casein kinase 1α,CK1α)、Axin、PP2A等組成的降解復(fù)合物磷酸化，導(dǎo)致其發(fā)生泛素化隨后被蛋白酶體降解，使胞內(nèi)的β-catenin保持在較低的水平。當(dāng)Wnt通路發(fā)生活化后，β-catenin降解復(fù)合物的活性被抑制，使得細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin不斷積累，從而促進(jìn)部分β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)生活化并與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，β-catenin的表達(dá)及亞細(xì)胞定位是檢測(cè)Wnt通路是否激活的重要標(biāo)志[10-11]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種較為保守的發(fā)育程序，是指細(xì)胞在多種蛋白的調(diào)控下失去上皮特性轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型的過(guò)程，其機(jī)制十分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)EMT增強(qiáng)細(xì)胞的遷移性、侵襲性、對(duì)凋亡的抵抗性等，因此EMT被認(rèn)為是影響癌細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵途徑[12-13]。有研究[14-16]表明，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤類型中Wnt/β-catenin信號(hào)通路均參與了EMT的調(diào)節(jié)。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種Ca2+依賴性跨膜糖蛋白。有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)惡性腫瘤中E-cadherin表達(dá)降低可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，其高表達(dá)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲，表明E-cadherin和MMP2是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的重要指標(biāo)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減miR-3200-3p總β-catenin、胞核β-catenin、胞漿β-catenin和MMP2蛋白表達(dá)均顯著降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，提示這種抑制作用很可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路的活性實(shí)現(xiàn)的，但具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，本實(shí)驗(yàn)顯示miR-3200-3p在HCC中可能發(fā)揮促癌基因作用，敲低其表達(dá)能顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且這種抑制作用可能是通過(guò)影響Wnt/β-catenin通路的活性，進(jìn)而下調(diào)MMP2表達(dá)，上調(diào)E-cadherin而實(shí)現(xiàn)的。