文穎娟 陳茉 趙歡 陳麗娟 王江

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

重癥肌無力(Myasthenia gravis，MG)主要是由抗體介導(dǎo)的獲得性神經(jīng)-肌肉接頭傳遞障礙的自身免疫性疾病，以眼肌或全身肌無力為主要臨床表現(xiàn)，研究表明，乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AchR)抗體是MG發(fā)病的關(guān)鍵[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，MG全球患病率為(150～250)/百萬[2]，我國MG發(fā)病率為0.68/10萬，各個(gè)年齡段均可發(fā)病，兒童及青少年MG患病高達(dá)50%[3]。臨床主要采取膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑、補(bǔ)體抑制劑、生物制劑等藥物治療手段[4]，雖在一定程度上緩解患者臨床癥狀，但長期服藥患者易出現(xiàn)股骨頭壞死、肝腎功能損害、內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡以及精神障礙等一系列不良反應(yīng)，且部分患者會(huì)誘發(fā)MG危象，危及生命。

MG以全身肌肉病變?yōu)橹?，屬于中醫(yī)“痿證”范疇。基于“脾主肌肉”，痿證雖有痰濁、水濕、瘀血等濁邪堆積，卻以脾虛為發(fā)病之本；線粒體是機(jī)體的動(dòng)力工廠，MG雖以過量AchR抗體堆積以病理表現(xiàn)，而其深層次機(jī)制可能以線粒體功能失常為主。故統(tǒng)一于“痿證”與MG 的“脾-肌肉-線粒體”密切相關(guān)，而線粒體功能失常，可能取決于線粒體質(zhì)量控制(Mitochondrial quality control，MQC)，既有其形成的源頭如骨骼肌干細(xì)胞異常，又有其自身的融合與裂解、自噬與修復(fù)等的復(fù)雜因素影響。故線粒體質(zhì)量控制的多樣性決定了中醫(yī)學(xué)“痿證”的發(fā)病圍繞脾虛可能有豐富的內(nèi)涵，故圍繞“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”的研究指導(dǎo)MG臨床可能更有針對(duì)性。

1 基于“脾主肌肉”的前期研究為“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)

1.1文獻(xiàn)研究顯示葛根具有輸肌以散邪與升精以濡養(yǎng)機(jī)體之功 脾胃為人體氣血生化之源?！捌⒅骷∪狻?，是指全身肌肉的運(yùn)動(dòng)變化均與脾的臟腑功能變化密切相關(guān)，肌肉運(yùn)動(dòng)來源于脾所化生的精微物質(zhì)，故肌肉運(yùn)動(dòng)失常可通過調(diào)理脾胃功能而得以緩解甚至治愈。中醫(yī)歸經(jīng)理論指出，某種藥物對(duì)某些臟腑經(jīng)絡(luò)的病變起主要或特殊作用，而對(duì)其他臟腑經(jīng)絡(luò)則作用較少，故中醫(yī)臨床常以歸脾胃經(jīng)藥物來調(diào)理脾胃功能。我們前期文獻(xiàn)研究表明：歸脾胃經(jīng)藥物葛根，具有祛邪(如解肌、生津、退熱、透疹等)和扶助正氣(升精、止渴)的雙重功效[5-6]。

基于“脾主肌肉”理論，葛根祛邪(和扶正)功能發(fā)揮的靶點(diǎn)可能在肌肉，而本草書籍對(duì)于葛根解肌升津之功效早有記載，如《藥類法象》載：“葛根，治脾胃虛而渴，善解酒毒，通行足陽明脈經(jīng)之藥”；《本草乘雅半偈》載：“葛根，作用部位在肌分；解廣義之痹，諸痹、諸毒、陰氣不起皆為痹?！蓖瑫r(shí)肌肉遍布全身，葛根通過輸肌以散邪(即促進(jìn)肌肉的運(yùn)動(dòng)以祛除濁邪)，亦可升發(fā)脾氣、布散精津，為全身肌肉提供能量，而其配伍不同可能作用不同，且作用于平滑肌、心肌等不同肌肉部位[5-7]。

1.2實(shí)驗(yàn)研究顯示葛根隨配伍不同，作用于不同的肌層 鑒此，課題組立足“脾主肌肉”，結(jié)合對(duì)“線粒體”研究，分別探討了葛根與黃芩、黃連等配伍對(duì)結(jié)腸平滑肌的作用，葛根與瓜蔞、薤白、丹參等配伍對(duì)心肌作用的實(shí)驗(yàn)研究，研究結(jié)果顯示：葛根能夠促進(jìn)胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)，治療潰瘍性結(jié)腸炎效果明顯[8-9]；葛根及其配伍可通過調(diào)節(jié)心肌線粒體功能，改善心肌纖維化，治療糖尿病心肌病[10-13]。

1.3基于“脾-肌肉-線粒體”，葛根及其配伍可作用于重癥肌無力骨骼肌線粒體 葛根是否作用于骨骼肌？重癥肌無力是以骨骼肌的運(yùn)動(dòng)失常為主，中藥葛根既能夠升發(fā)脾氣以輸布津液，又可輸散以調(diào)節(jié)肌肉的運(yùn)動(dòng)變化，是否能夠作為重癥肌無力治療的主藥?現(xiàn)代名老中醫(yī)周仲瑛[14]、裘昌林[15]、李聲岳[16]等均以葛根為主配伍治療重癥肌無力，均為開展以葛根為主治療重癥肌無力研究提供有力佐證。

故此，課題組以MG為切入點(diǎn)，針對(duì)MG病機(jī)以脾氣不足，生化乏源，無法濡養(yǎng)肌肉，導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)無力的虛證為主；又兼見脾胃升清降濁失常，引起濕熱、瘀血等濁邪壅滯(如MG中AchR-Ab的過度增加)之實(shí)證，以既有升發(fā)脾氣布散津液之功，又可輸肌以促進(jìn)肌肉運(yùn)動(dòng)的葛根，作為重癥肌無力治療的主藥；并針對(duì)脾氣虛以及瘀血濕熱阻滯的病機(jī)，則分別與益氣健脾的代表藥物黃芪、活血化瘀的代表藥物丹參以及治療痿證的四妙散配伍，發(fā)揮益氣升陽，發(fā)揮利濕活血或益氣輸肌，利濕活血之功效。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[17-23]，脾為肌肉提供氣血，線粒體為肌肉提供能量，脾與線粒體密切相關(guān)，即“脾-肌肉-線粒體”相關(guān)，而基于“脾主肌肉”理論，歸脾胃經(jīng)藥物葛根實(shí)質(zhì)作用于肌肉線粒體發(fā)揮作用，葛根及其配伍通過減少骨骼肌乙酰膽堿受體抗體的堆積和增強(qiáng)骨骼肌線粒體功能而發(fā)揮其治療作用，其對(duì)線粒體的作用是通過調(diào)控骨骼肌成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)，進(jìn)而改善EAMG大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)與功能。而線粒體作用的增強(qiáng)，也會(huì)緩解甚至降低乙酰膽堿受體抗體的堆積，促進(jìn)神經(jīng)肌肉接頭部位傳導(dǎo)正常，緩解MG,故線粒體作用失常是MG 發(fā)病的關(guān)鍵。

1.4基于“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”，葛根及其配伍治療重癥肌無力的深層次機(jī)制可能為保證線粒體的源頭與活力 痿證病本在于脾氣虛，難以化生氣血濡養(yǎng)肌肉；運(yùn)化無力，產(chǎn)生痰濁、水濕、瘀血等濁邪堆積，進(jìn)一步阻滯氣血輸布，肌肉運(yùn)行所需氣血乏源，影響肌肉運(yùn)動(dòng)?；贛G與痿證，脾氣虛是其病機(jī)之本，骨骼肌線粒體作用失常是MG發(fā)病的關(guān)鍵，而線粒體作用失常的調(diào)控是基于線粒體質(zhì)量控制，包括如何形成優(yōu)質(zhì)的線粒體，以及如何保證優(yōu)質(zhì)線粒體充滿活力。故結(jié)合腎為后天之本，腎主骨，可針對(duì)MG骨骼肌無力以填精益髓，在前期葛根及其配伍基礎(chǔ)上，增加熟地填精益髓，與黃芪配伍，發(fā)揮其升發(fā)脾陽、滋養(yǎng)肌肉的作用，而其配伍也體現(xiàn)了調(diào)動(dòng)脾腎之先后天之本，使氣血生化有源，也使優(yōu)質(zhì)線粒體生成有源，并保持優(yōu)質(zhì)線粒體持續(xù)活力。以此，葛根及其配伍對(duì)重癥肌無力的深層次機(jī)制可能是以保障線粒體質(zhì)量控制為主(見圖1)，而線粒體質(zhì)量控制的具體內(nèi)涵分析也是研究的前提。

圖1 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)線粒體調(diào)節(jié)示意圖

2 恢復(fù)骨骼肌干細(xì)胞再生修復(fù)功能是形成優(yōu)質(zhì)線粒體的基礎(chǔ)

MG是以骨骼肌功能失常為主，骨骼肌由大量的肌纖維束組成，其功能的維持取決于肌纖維再生能力。肌纖維再生則有賴于(Muscle stem cells，MSCs)的自我更新、高度增殖與肌源性分化[24]。有研究表明，當(dāng)新生肌肉組織出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致肌肉干細(xì)胞在數(shù)量和功能上存在明顯缺陷，出現(xiàn)進(jìn)展型肌退化或肌萎縮現(xiàn)象[25]。

因此，骨骼肌干細(xì)胞再生修復(fù)是MG治療的關(guān)鍵，而MSCs的生長發(fā)育受多種因素調(diào)控，多種信號(hào)因子和生長因子參與其中(見圖2)。以恢復(fù)骨骼肌干細(xì)胞再生修復(fù)功能為前提，重建受損骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能，實(shí)現(xiàn)恢復(fù)骨骼肌線粒體質(zhì)量的目標(biāo)。

圖2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞再生修復(fù)過程

2.1Myod和Pax7動(dòng)態(tài)變化保護(hù)正常MSCs增殖，保障骨骼肌再生修復(fù) 肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(myoblastdetermining，Myod)是反應(yīng)肌肉細(xì)胞再生的主要指標(biāo)[26]，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，當(dāng)肌肉出現(xiàn)損傷后，MSCs啟動(dòng)Myod基因，肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)；上調(diào)Myod蛋白表達(dá)，能夠促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，發(fā)揮保護(hù)骨骼肌正常功能的作用[27]。

Pax7作為一種成肌性誘導(dǎo)物，隨著Pax7的表達(dá)下降，骨骼肌干細(xì)胞逐漸失去干性，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞[28]，這對(duì)于骨骼肌的發(fā)育、再生和修復(fù)具有至關(guān)重要的意義。同時(shí)，Pax7能夠通過促進(jìn)Myod降解，降低Myod的表達(dá)，保護(hù)正常MSCs增殖、保障骨骼肌再生修復(fù)[29]。但對(duì)其影響機(jī)制尚未完全明確。

2.2P38MAPK、AMPK信號(hào)通路相互調(diào)節(jié)MSCs再生修復(fù) 作為調(diào)控骨骼肌線粒體的重要通路之一，P38MAPK信號(hào)通路通過參與成肌細(xì)胞分化，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，廢用性肌萎縮的大鼠骨骼肌中P38MAPK的蛋白表達(dá)顯著低于正常組，調(diào)節(jié)P38MAPK信號(hào)通路，有效調(diào)控大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，保障線粒體正常功能，增加肌肉總量[30]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的開關(guān)，研究證實(shí)，其不僅能夠有效刺激線粒體自噬發(fā)生，清除受損線粒體，保障線粒體能量供給，改善MG癥狀，同時(shí)通過調(diào)控自噬-溶酶體途徑發(fā)揮維持骨骼肌質(zhì)量，緩解肌萎縮的重要作用[31]。

3 動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量控制是保障優(yōu)質(zhì)線粒體功能的核心

近幾年來，隨著對(duì)線粒體認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)線粒體作為動(dòng)態(tài)細(xì)胞器，在人體生長、運(yùn)動(dòng)、饑餓、炎癥、缺氧等刺激作用下，能夠通過線粒體融合/分裂，線粒體自噬、線粒體生物合成的協(xié)同調(diào)控，形成一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的可塑性網(wǎng)絡(luò)，限制和延緩功能受損線粒體的積累，維持線粒體數(shù)量、形態(tài)和功能的動(dòng)態(tài)平衡[32]，實(shí)現(xiàn)線粒體質(zhì)量控制。

線粒體質(zhì)量控制，存在正向和逆向兩個(gè)對(duì)立統(tǒng)一方面，是發(fā)揮線粒體正常生理功能的核心，是維持細(xì)胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[33]。不僅包含線粒體的新生，同時(shí)包含對(duì)損傷或衰老線粒體的清除，主要包括線粒體生物合成、線粒體動(dòng)力學(xué)、線粒體自噬、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)四個(gè)方面[34-36](見圖3)。

圖3 線粒體質(zhì)量控制調(diào)節(jié)示意圖

3.1PGC-1α和NRF的協(xié)同表達(dá)促進(jìn)線粒體生物合成 線粒體生物合成是增加細(xì)胞中線粒體質(zhì)量的過程，通過維持線粒體正常功能保障線粒體質(zhì)量控制[37]。需要包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1，PGC-1α)和核呼吸因子(nuclear respira-tory factor，NRF) 在內(nèi)的多種因子協(xié)同表達(dá)[38]。

PGC-1α作為調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體生物發(fā)生的主控基因，能夠引發(fā)胞漿中鈣離子濃度升高，并通過激活鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(CaMK)和鈣神經(jīng)素響應(yīng)基因，參與線粒體生物合成等多種生物過程[39]。

NRF-1作為線粒體基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞核與線粒體通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用[40]，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NRF-1與共激活劑PGC-1α相互作用，將有助于細(xì)胞核和線粒體呼吸基因的表達(dá)[41]，改善骨骼肌線粒體生物發(fā)生，維持骨骼肌線粒體正常功能，保障線粒體質(zhì)量控制。

3.2通過相關(guān)蛋白對(duì)線粒體分裂與融合的調(diào)節(jié)促進(jìn)線粒體動(dòng)力學(xué)正常表達(dá) 線粒體正常情況下，能夠通過快速和可逆的分裂融合過程，完成從小圓形細(xì)胞器到巨大管狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，這一動(dòng)態(tài)過程稱為線粒體動(dòng)力學(xué)[42]。它與細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等各種生物學(xué)功能密切相關(guān)。若線粒體動(dòng)力學(xué)失調(diào)將導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。骨骼肌高度依賴線粒體動(dòng)力學(xué)維持正常功能[43]，線粒體融合與分裂是對(duì)骨骼肌能量代謝的一種適應(yīng)性快速應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞存在分裂過度化，出現(xiàn)線粒體形態(tài)縮短，線粒體動(dòng)力學(xué)異?，F(xiàn)象[44]。

3.2.1Drp1與Fis1相互作用促進(jìn)線粒體分裂 動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-relatedprotein 1，Drp1)驅(qū)動(dòng)線粒體分裂，實(shí)驗(yàn)研究表明[45-47]，抑制Drp1的活性不僅抑制線粒體分裂，同時(shí)阻礙細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC) 和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF) 依賴的線粒體凋亡途徑。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中線粒體分裂蛋白1(Mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1)和 Drp1 相互作用，在維持線粒體完整性方面發(fā)揮重要作用[48]。Romanello等[49]通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，過表達(dá)Drp1或Fis1 將導(dǎo)致肌肉萎縮，而通過抑制骨骼肌線粒體分裂在一定程度上能夠降低肌萎縮現(xiàn)象。

3.2.2Mfn1、Mfn2與Opa1共同參與調(diào)節(jié)線粒體融合 線粒體融合主要受線粒體融合蛋白1/2(mitofusion 1 /2，Mfn1/2)、視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic dominant atrophy 1，Opa1)調(diào)控。Opa1作為線粒體內(nèi)膜重構(gòu)決定性因子之一，與Mfn1共同參與線粒體內(nèi)膜融合并維持嵴形態(tài)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在后肢廢用模型中線粒體融合基因Mfn1/2、Opa1基因表達(dá)顯著降低，小鼠骨骼肌橫疊面積下降[50]，證實(shí)線粒體融合與分裂在調(diào)控骨骼肌和肌肉質(zhì)量中發(fā)揮十分重要的作用。缺失Mfn1/2、Opa1將干擾線粒體的融合過程，導(dǎo)致正常線粒體功能受阻，影響線粒體的質(zhì)量。綜上，線粒體分裂可控制線粒體數(shù)目、調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑、介導(dǎo)細(xì)胞自噬，防止損傷線粒體的過度堆積；而線粒體融合則能夠在保障線粒體內(nèi)容物、調(diào)節(jié)線粒體嵴形態(tài)等方面發(fā)揮保障線粒體正常功能的作用，兩者相互影響，雙向調(diào)節(jié)，起到保障線粒體質(zhì)量控制的作用。因此，在線粒體質(zhì)量控制中起主導(dǎo)作用。

3.3PINK1/Parkin通路與線粒體外膜蛋白 FUNDC1協(xié)同介導(dǎo)線粒體自噬 從分子機(jī)制上來講，線粒體質(zhì)量控制不但涉及分子水平上單個(gè)蛋白質(zhì)的降解、合成和基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)包含在整個(gè)細(xì)胞器上線粒體的降解與新生[51]。而線粒體自噬(Mieap-inducedvacuole，MIV)作為一種選擇性自噬，能夠在應(yīng)激條件下通過選擇性清除受損或功能障礙的線粒體，完成識(shí)別去極化損傷線粒體，保障細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是線粒體質(zhì)量控制的核心[52]。

PINK1/Parkin信號(hào)通路，作為介導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬的主要途徑，在修復(fù)或清除損傷線粒體方面發(fā)揮重要價(jià)值[53]。線粒體外膜蛋白FUN14結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1,FUNDC1)在調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體質(zhì)量以及機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)維持中同樣起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)敲除小鼠骨骼肌特異性線粒體外膜蛋白FUNDC1，可以導(dǎo)致 LC3介導(dǎo)的線粒體自噬受阻，影響線粒體 ATP 能量生成，導(dǎo)致骨骼肌脂肪酸利用率下降[54]。

因此，通過調(diào)節(jié)線粒體自噬清除損傷線粒體，防止異常線粒體的過度堆積，從而保障線粒體質(zhì)量控制，對(duì)于恢復(fù)MG骨骼肌線粒體具有重要意義。

另外，Mieap(Mitochondria-eatingprotein)作為一種新型分子，能夠通過介導(dǎo)線粒體自噬，即細(xì)胞自噬選擇性地清除受損線粒體[55]。若 Mieap 對(duì)線粒體的修復(fù)或清除受損，則可能導(dǎo)致大量異常線粒體堆積。

3.4調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以維持線粒體跨膜電位正常 線粒體除產(chǎn)生ATP外，也是細(xì)胞鈣(Ca2+)的主要儲(chǔ)存中心。通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，能夠防止炎性因子過度表達(dá)，維持線粒體跨膜電位正常，提高ATP活性，恢復(fù)細(xì)胞線粒體正常功能，是線粒體質(zhì)量控制的有效保障之一。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛MG患者外周血淋巴細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯降低(P<0.01)[56]。細(xì)胞內(nèi)離子濃度無法保持平衡，影響細(xì)胞能量代謝受損。為從亞細(xì)胞分子水平上治療MG提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)[57]。

綜上，本研究在前期“脾-肌肉-線粒體”研究基礎(chǔ)上，從MG病理以線粒體功能失常為關(guān)鍵點(diǎn)，基于“脾主肌肉”，結(jié)合中醫(yī)學(xué)“痿證”以脾虛為本、虛實(shí)夾雜的病機(jī)特點(diǎn)，延伸研究“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”，而線粒體質(zhì)量控制源于骨骼肌干細(xì)胞，受制于線粒體自身動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，故探討葛根及其配伍可能通過兩個(gè)層次調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量，治療重癥肌無力：

其一，在形成更多優(yōu)質(zhì)線粒體層面，從骨骼肌干細(xì)胞為切入，通過Myod與Pax7動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以及P38 MAPK、AMPK信號(hào)通路激活，保護(hù)正常MSCs增殖，保障骨骼肌再生修復(fù)，使優(yōu)質(zhì)線粒體生成有源；其二，在線粒體自身動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)層面，以線粒體生物合成、融合與分裂、自噬以及細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)為主，形成線粒體活力的高度動(dòng)態(tài)的可塑性網(wǎng)絡(luò)，保證優(yōu)質(zhì)線粒體充滿生機(jī)。