耿鑫 賈娜 張建平

(1.西安市第九醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；3.西安工會醫(yī)院，陜西 西安 710100)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫系統(tǒng)疾病[1-2]，其臨床癥狀表現(xiàn)為關節(jié)滑膜炎癥、血管翳的形成，并最終導致關節(jié)軟骨病變，嚴重者關節(jié)畸形甚至殘廢[3-4]。青葉膽來源于龍膽科獐牙菜屬植物青葉膽(SwertiamileensisT.N.Hoet W.L.Shih,SWE)的全草，別名彌勒獐牙菜、金魚膽、走膽藥，生長于我國西藏、云南、川西等海拔約為1300～1700 m的山上，是一味使用歷史悠久的藏藥?？捎糜谥委燑S疸、濕熱病、赤尿澀痛等癥[5-6]。青葉膽作為民族用藥已被佤醫(yī)常用青葉膽和龍膽草配伍治療肝炎、膽囊炎等[7-9]，本課題組之前已對青葉膽藥材進行了質量標準研究，文獻報道青葉膽可調節(jié)T淋巴細胞亞群從而提高免疫功能[10-11]，然而青葉膽發(fā)揮抗炎作用的靶點和機制尚不明確。本文擬構建膠原誘導關節(jié)炎模型，通過研究該模型中的關節(jié)炎相關評價指數(shù)、關節(jié)病理學變化以及基質金屬蛋白酶的水平，來闡述青葉膽在RA發(fā)生發(fā)展中的保護作用和分子作用機制，為青葉膽防治類風濕關節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 MSE1203S-DE電子天平(Sartorius)；Eppendorf 5417R高速冷凍離心機，RM2235切片機(德國LEICA公司)；勻漿器(德國IKA公司)，HistoStar包埋機(Thermo)；IX71倒置熒光顯微鏡(Olympas)。

1.2試藥 SWE購于安國市涵博堂中藥材銷售有限公司，并經(jīng)西北大學生命科學與醫(yī)學院王亞洲教授鑒定，粉碎后過60目篩。地塞米松片(每片0.75 mg，批號：12020293)購于天津太平洋制藥有限公司；雞Ⅱ型膠原(批號202009)購于美國Sigma公司；Freund complete adjuvant和Freund incomplete adjuvant(批號：F56354)購于美國Chondrex公司；HE染色劑(批號：G1120)購于北京索萊寶科技有限公司；MMP9(貨號：AM1975a)單克隆抗體購于abgent公司；小鼠白細胞介素(IL) -1β(批號：M420AB)、IL-6(批號：M620)、人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(貨號：12-7321-82)均購于Invitrogen公司。

1.3實驗動物 選取10～14周齡的雄性C57BL6J小鼠，購自第四軍醫(yī)大學試驗動物中心，許可證號：SCXK(陜)2007-0007。分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，確定動物狀態(tài)良好。

2 方法

2.1SWE的制備 將陰干的青葉膽200 g 粉碎，過20 目篩，用少量75%甲醇拌勻并浸泡12 h，待其潤脹后用75%乙醇進行滲漉提取，薄層色譜(TLC)下檢視，直至薄層板上幾乎看不到斑點時停止?jié)B漉。合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，最后將提取液濃縮成浸膏狀，即得SWE(經(jīng)HPLC測定，提取物中龍膽苦苷含量為50.23%、落苷酸含量為15.29%、獐牙菜苷含量為11.65%、獐牙菜苦苷含量為10.18%)。將所制SWE密封，滅菌，于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

2.2模型構建與分組 將雞二型膠原(Chicken type Ⅱ,CⅡ)溶解于0.1 M的冰醋酸中，使其濃度為4 mg·mL-1。相同體積膠原與弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant，CFA)混合后充分勻漿乳化制成乳劑。免疫動物：在小鼠尾根部位皮內注射0.1 mL混合乳劑，其中含200 mg結核分枝桿菌和100 mg二型膠原。加強免疫：首次注射14 d后重復上述免疫步驟，并要遠離第一次的注射部位。對照組注射同體積的生理鹽水[12-13]。在實驗第14 d開始進行查看并記錄關節(jié)炎指數(shù)(AI)，按AI值≥2分為造模成功。

將動物隨機分成5組，每組8只，分別為正常組、CIA模型組、陽性藥(地塞米松，0.25 mg·kg-1)組即DEX組、SWE組(25 mg·kg-1，L組)和SWE組(50 mg·kg-1，H組)。各組灌胃給藥，一次·d-1，共持續(xù)28 d，正常組和模型組灌胃同體積的生理鹽水。

2.3相關指數(shù)評估 評估關節(jié)炎指數(shù)(AI)采用5級評判標準[7-8]：0分為無紅腫；1分為關節(jié)輕度腫脹；2分為小趾關節(jié)及足趾關節(jié)腫脹；3分為踝關節(jié)以下足爪腫脹；4分代表踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹并且不能負重。小鼠繼發(fā)側足爪AI評分之和即為該小鼠的AI評分(總分為16分)。

脾臟指數(shù)(splenic index，SI)和胸腺指數(shù)(thymusindex，TI)：評估待小鼠死亡后解剖并摘取小鼠胸腺和脾臟，稱濕重，根據(jù)公式：脾臟指數(shù)=脾臟質量(g)/體重(g)，胸腺指數(shù)=胸腺質量(g)/體重(g)，分別計算。

2.4關節(jié)病理學變化 采用hematoxylin-eosin staining染色法對小鼠關節(jié)染色。取動物后踝關節(jié)，使用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm切片，蘇木素-伊紅染色，200倍下顯微鏡觀察小鼠組織病理學改變。

2.5血清中炎性因子的含量 采用ELISA法進行測定。取血后3 000 r·min-1離心10 min，取上清按照ELISA試劑盒說明書分別測定TNF-α，IL-1β和IL-6的含量。

2.6測定關節(jié)滑膜中MMP-9的蛋白表達 采用Western blot法檢測蛋白水平。取新鮮小鼠關節(jié)組織100 mg置于勻漿器，冰上研磨提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳，5%的濃縮膠80 V，25 min，15%的分離膠120 V，40 min；150 A轉膜2 h；脫脂奶粉封閉2 h；加入一抗(MMP-9和β-actin，1∶1 000)置于搖床4℃過夜；TBST洗膜3次，每次15 min ；二抗(1∶1 200)于室溫孵育2 h；TBST溶液洗膜3次，每次15 min；加入顯影液配制1 mL(1∶1)，放入化學發(fā)光儀檢測；采用Quantity One 軟件分析條帶，計算分析MMP-9和β-actin條帶的灰度比值。

3 結果

3.1對關節(jié)炎指數(shù)(AI)的影響 與正常組相比，CIA模型組、SWE H組、SWE L組小鼠AI值升高(P<0.05)；與CIA模型組比較，地塞米松組和SWE H組AI值從第7 d開始呈顯著性降低(P<0.05)，SWE L組從第14 d開始AI值降低(P<0.05)，結果見表1。

表1 SWE對AI值的影響

3.2對臟器指數(shù)(SI和TI)的影響 與正常組比較，CIA模型組、SWE H組、SWE L組的小鼠SI、TI值升高(P<0.05)；與CIA模型組比較，地塞米松和SWE H組、SWE L組均能使SI和TI值的減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果見表2。

表2 對SI和TI值的影響

3.3對小鼠關節(jié)組織病理學變化的影響 在顯微鏡下可看到：與control組相比較，CIA組滑膜排列不夠緊密，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，并且伴有淋巴細胞增生及血管翳形成的現(xiàn)象；與CIA模型組相比，DEX組及SWE H組滑膜排列整齊，組織緊密，炎性細胞減少，SWE L組較模型組病理學變化不明顯，結果詳見圖1。

圖1 對小鼠踝關節(jié)滑膜組織病理變化的影響(HE，×200)

3.4對炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平的影響 與正常組相比，CIA模型組中炎性因子(IL-1β、IL-6 和TNF-α)的含量分別為(24.63±1.41)、(90.76±5.09)和(16.23±4.21) pg·mL-1(P<0.05)；與CIA組相比，DEX組及SWE H、SWE L組血清IL-1β，IL-6 和TNF-α的含量均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 對CIA小鼠血清中IL-1β，IL-6 和TNF-α含量的影響

3.5對滑膜組織中MMP-9含量的影響 經(jīng)western bloting法檢測，CIA模型組與正常組相比，關節(jié)滑膜組織中MMP-9的蛋白表達水平是正常組的3.6倍(P<0.05)，而較CIA模型組，DEX組降低至正常組的2.2倍，SWE H組和SWE L組分別降低至正常組的1.9倍和2.5倍，數(shù)據(jù)均具有顯著性差異(P<0.05)。結果證實SWE能夠抑制MMP-9在CIA小鼠滑膜組織中的高表達水平。見圖2。

4 討論

全球RA的發(fā)病率為0.5%～1.0%，是一種以反復發(fā)作的四肢對稱性多關節(jié)腫脹、疼痛、功能障礙甚至關節(jié)畸形為特點的慢性自身免疫性疾病，關節(jié)侵蝕、軟骨破壞及慢性滑膜炎是臨床常見表現(xiàn)，甚至會導致殘廢，極大影響到患者的生存質量[14]?；|金屬蛋白酶(MMP)在細胞外基質降解及重構的中起到重要作用，對細胞外基質有高效的降解能力，從而導致軟骨損傷[15]。MMPs會在關節(jié)炎軟骨交界間隙及關節(jié)的其他部位呈現(xiàn)高水平表達。其作用機制可能為以下兩條途徑：① MMPs可降解關節(jié)軟骨及骨質；②血管再生時，MMPs可降解微血管基底膜和間質成分，進而形成血管翳。研究顯示，降低關節(jié)組織中MMP-9的表達，能夠有效地保護RA病人的關節(jié)損傷[16-17]。因此，將MMPs作為RA的靶點成為了現(xiàn)階段研究治療RA的焦點。

青葉膽來源于龍膽科獐牙菜屬植物青葉膽的全草，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙的作用[1]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，同屬龍膽科植物的秦艽提取物具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[18-20]，青葉膽和秦艽化學成分組成相似，因此本文我們探討了同屬植物藥青葉膽是否具有抗RA的作用，并進一步考察其究竟是通過何種作用機制來發(fā)揮抗RA作用的。實驗數(shù)據(jù)表明，SWE H組和SWE L組均能顯著抑制CIA小鼠的AI指數(shù)和臟器指數(shù)(SI、TI)，SWE H組中滑膜排列整齊，組織緊密，炎性細胞減少，SWE H和SWE L顯著抑制血清中炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平，抑制MMP-9在CIA小鼠關節(jié)滑膜組織中的高表達。綜上所述，本實驗首次證實SWE能夠改善CIA小鼠炎癥狀態(tài)，其作用機制可能是通過降低CIA小鼠血清中炎性因子(IL-1β，IL-6和TNF-α)的含量，以及抑制MMP-9在關節(jié)組織中的高表達水平，從而發(fā)揮治療類風濕關節(jié)炎的療效，為深入探討青葉膽醇提物抗RA作用機制提供了理論支撐，為青葉膽資源的開發(fā)提供幫助。

由于目前關于青葉膽研究較少[21]，其中具體是哪些成分為抗RA的藥效物質基礎，以及具體的分子作用機制有待課題組深入考察。