韓文凱,許曉燕,李丹霞,車鎧,焦偉,牛海濤

[摘要]目的? ?探究自噬基因與膀胱癌預(yù)后的相關(guān)性。方法? 從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲取膀胱癌組織與瘤旁組織差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因（DEARGs），對DEARGs進(jìn)行生物學(xué)功能分析，篩選與生存相關(guān)的自噬基因，并構(gòu)建風(fēng)險模型，利用模型預(yù)測膀胱癌病人的生存狀態(tài);同時利用外部數(shù)據(jù)集驗證模型的準(zhǔn)確性，并判斷模型的穩(wěn)定性;最后驗證該模型是否可以作為膀胱癌預(yù)后的獨立因素。結(jié)果? ?對430例樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得了37個DEARGs（|logFC|>1，F(xiàn)DR<0.05）。DEARGs的生物學(xué)功能主要富集于自噬功能和癌癥相關(guān)通路。模型預(yù)測結(jié)果顯示，高風(fēng)險組3年生存率為41.4%（95%CI=0.334～0.513），低風(fēng)險組3年生存率為57.7%（95%CI=0.490～0.679）。外部數(shù)據(jù)集驗證顯示，模型具有穩(wěn)定的預(yù)測性，高風(fēng)險組3年生存率為31.6%（95%CI=0.3167～0.499），低風(fēng)險組3年生存率為64.6%（95%CI=0.436～0.665），且該模型風(fēng)險評分可以作為膀胱癌預(yù)后的獨立因素。結(jié)論? ?自噬基因與膀胱癌的預(yù)后生存相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]膀胱腫瘤;自噬基因;比例危險度模型;癌癥基因組圖譜

[中圖分類號]R737.14

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2022）04-0475-05

doi： 10.11712/jms.2096-5532.2022.58.104[HT]

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220622.1558.003.html;[JY]2022-06-2410：59：34

AN ANALYSIS OF AUTOPHAGY-RELATED GENES AND THEIR PROGNOSTIC SIGNIFICANCE IN BLADDER CANCER

HAN Wenkai， XU Xiaoyan， LI Danxia，? CHE Kai， JIAO Wei， NIU Haitao

（Department of Medicine， Qingdao University， Qing-

dao 266071， China）

[ABSTRACT]] Objective? ?To investigate the relationship between autophagy genes and the prognosis of bladder cancer.

Methods The differentially expressed autophagy-related genes （DEARGs） in bladder cancer tissues and paracancerous tissues were obtained from The Cancer Genome Atlas. The biological functions of the DEARGs were analyzed to screen for survival-related autophagy genes and to construct a risk model to predict the survival status of bladder cancer patients. The accuracy of the model was validated using an external dataset and the stability of the model was judged. Finally， the model was validated as an indepen-

dent factor for predicting bladder cancer prognosis.

Results The differential expression analysis of the transcriptomic data from 430 samples resulted in 37 DEARGs （|logFC|>1， FDR<0.05）. The biological functions of the DEARGs were mainly concentra-

ted on autophagic function and cancer-related pathways. The model predictions showed that the 3 year survival rate was 41.4% （95%CI=0.334-0.513） for the high-risk group and 57.7% （95%CI=0.490-0.679） for the low-risk group. The external dataset demonstrated a stable predictive validity of the model， with a 3 year survival rate of 31.6% （95%CI=0.3167-0.499） in the high-risk group and 64.6% （95%CI=0.436-0.665） in the low-risk group， and the model could be used as an independent factor for predicting bladder cancer prognosis.

Conclusion[WTBZ] Autophagy genes are associated with prognostic survival in bladder cancer.

[KEY WORDS] urinary bladder neoplasms; autophagy related genes; proportional hazards models; the cancer genome atlas

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，也是我國老年人群中高致死率的癌癥[1-2]。膀胱癌最常見的病理類型是尿路上皮癌，其具有耐藥性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點[3-4]。雖然手術(shù)、放療和輔助化療的應(yīng)用大大改善了膀胱癌病人的預(yù)后，但膀胱癌致死率仍居高不下[5]。因此，需要尋找新的方法來提高膀胱癌病人的診斷和預(yù)后。近年來，分子標(biāo)志物已經(jīng)被證實有助于膀胱癌的診斷和治療[6]。已有研究表明，膀胱癌病人的晚期無進(jìn)展生存與某些分子標(biāo)志物高表達(dá)相關(guān)[7-8]。然而，由于研究缺乏更大的臨床研究隊列，這些潛在生物標(biāo)志物的功能以及臨床意義無法得到充分驗證。自噬在細(xì)胞的代謝過程中具有平衡作用，正常情況下自噬可以清除功能受損的細(xì)胞器以及表達(dá)錯誤的蛋白質(zhì)[9]。人類發(fā)展過程中的多種疾病與自噬相關(guān)，并且自噬與腫瘤的發(fā)生也存在密切關(guān)系[10]。自噬對于腫瘤是一把雙刃劍，早期可以抑制腫瘤的形成，晚期可以促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[11]。近年來有研究表明，自噬基因可以通過信號通路誘導(dǎo)膀胱癌浸潤和轉(zhuǎn)移[12-13]。因此，自噬基因可能作為膀胱癌診斷以及預(yù)后的分子標(biāo)志物。本研究從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲取膀胱癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并且構(gòu)建自噬相關(guān)基因（DEARGs）的預(yù)后模型，評估該模型的預(yù)后預(yù)測能力。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取了430例樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（HTSeq-FPKM），其中癌旁組織19例，膀胱癌組織411例。GSE31684數(shù)據(jù)集從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE31684）中下載獲得[14-15]。DEARGs來源于人類自噬數(shù)據(jù)庫（HADb，http：//www.autophagy.lu/），從該數(shù)據(jù)庫中獲得了232個自噬基因，其中194個基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中表達(dá)。

1.2DEARGs差異表達(dá)分析

對瘤旁組織和膀胱癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)的DEARGs。在R語言（版本3.6.2）環(huán)境下進(jìn)行操作，首先使用“l(fā)imma”包對數(shù)據(jù)進(jìn)行校正歸一化處理，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|>1（實驗組/對照組>2），錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05。采用Wilcoxon檢驗進(jìn)行差異分析，最后使用“pheatmap”和“ggpubr”包對DEARGs進(jìn)行可視化處理。

1.3DEARGs在膀胱癌中的生物學(xué)功能分析

對DEARGs進(jìn)行基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。在R語言環(huán)境下，使用“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterProfiler”和“enrichplot”等軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理（P<0.05，Q<0.05，Q值為校正后的P值）。

1.4DEARGs預(yù)后風(fēng)險模型的構(gòu)建

首先，在R語言環(huán)境下使用“survival”軟件包對DEARGs進(jìn)行單因素Cox回歸分析，篩選與預(yù)后生存相關(guān)的自噬基因，以P<0.05為差異有顯著意義。隨后，將以上篩選到的與生存相關(guān)的自噬基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析。最后，構(gòu)建自噬基因的風(fēng)險預(yù)測模型，根據(jù)風(fēng)險模型計算每一樣本的風(fēng)險評分，

以風(fēng)險評分中位值為界將樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，觀察兩組病人生存狀態(tài)。風(fēng)險評分=

expRNA1×βRNA1+expRNA2×βRNA2+…+expRNAn×βRNAn，其中exp是差異表達(dá)基因的表達(dá)量，RNA1～RNAn代表每一基因的名稱，β是Cox回歸模型的多元回歸系數(shù)。

1.5預(yù)后風(fēng)險模型的評估

在R語言環(huán)境下使用“survival”包對高低風(fēng)險組的病人進(jìn)行預(yù)后分析，利用Kaplan-Meier（K-M）檢驗方法和log-rank檢驗評估高低風(fēng)險組病人的生存預(yù)后。使用“survival ROC”包繪制受試者工作特征（ROC）曲線評估該模型的準(zhǔn)確性。

1.6外部數(shù)據(jù)集對于模型的驗證

使用GSE31684數(shù)據(jù)集驗證風(fēng)險模型的預(yù)測性能，根據(jù)模型風(fēng)險評分的中位值將樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，觀察兩組病人總體生存狀態(tài)，繪制ROC曲線評估結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.7獨立預(yù)后分析

將樣本的風(fēng)險評分和臨床指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，綜合評估風(fēng)險評分與膀胱癌病人預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1DEARGs的篩選

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)（|logFC|>1、FDR<0.05）獲得DEARGs 37個，其中19個基因表達(dá)下調(diào)，18個基因表達(dá)上調(diào)（圖1A）。依據(jù)|logFC|排序，表達(dá)上調(diào)的前

10個基因為：[STBX]CDKN2A、SERPINA1、BIRC5、

TP73、ATG9B、EIF4EBP1、SPHK1、ERBB2、BID和ITGA3;表達(dá)下調(diào)的前10個基因為：[STBX]FOS、CCL2、HSPB8、PRKN、ITPR1、TP53INP2、NRG2、MYC、DLC1和BCL2。

2.2DEARGs的生物學(xué)功能分析

GO富集分析的結(jié)果顯示，生物過程（BP）主要包含內(nèi)在凋亡信號通路、神經(jīng)元死亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、自噬和自噬信號通路等，細(xì)胞組成（CC）主要包含自噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔體、外膜、線粒體外膜和細(xì)胞器外膜等，分子功能（MF）主要涉及泛素蛋白連接酶的結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合、BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合及蛋白酶結(jié)合等。見圖1B。KEGG分析的結(jié)果則顯示，DEARGs主要與肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）、細(xì)胞凋亡、凋亡-多物種、膀胱癌、慢性骨髓性白血病、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、內(nèi)分泌的阻力、ErbB信號通路、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路和鉑耐藥等通路相關(guān)（圖1C）。

2.3自噬風(fēng)險模型的構(gòu)建與評估

[CM（20]對37個DEARGs進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有7個基因（[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3、MYC、SPHK1）與膀胱癌病人的預(yù)后顯著相關(guān)（P<0.05）。將其納入多因素Cox回歸分析，最終得到了包含6個自噬基因（[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3、MYC）的風(fēng)險模型。熱圖分析結(jié)果顯示，與低風(fēng)險組比較，高風(fēng)險組[STBX]DIRAS3、MYC、P4HB基因表達(dá)上調(diào)，[STBX]APOL1、ITGA3則表達(dá)下調(diào)，而[STBX]SPNS1的表達(dá)在兩組中并無明顯差異（圖2A）。低風(fēng)險組的總體生存優(yōu)于高風(fēng)險組（圖2B、C）。根據(jù)風(fēng)險模型計算了每例膀胱癌病人的風(fēng)險評分，高風(fēng)險組201例，低風(fēng)險組202例。K-M分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組3年生存率為41.4%（95%CI=0.334～0.513），低風(fēng)險組為57.7%（95%CI=0.490～0.679），高風(fēng)險組的預(yù)后生存率低于低風(fēng)險組（圖3A）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，膀胱癌病人3年生存期的AUC為0.789（圖3B）。

2.4外部數(shù)據(jù)集對于模型的驗證

使用GEO數(shù)據(jù)集中的GSE31684數(shù)據(jù)集對模型的預(yù)測能力進(jìn)行驗證，根據(jù)風(fēng)險模型的風(fēng)險評分，將病人分為高風(fēng)險組（46例）、低風(fēng)險組（47例）。K-M生存分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組的預(yù)后差于低風(fēng)險組，高風(fēng)險組的3年生存率為31.6%（95%CI=0.3167～0.499），低風(fēng)險組3年生存率為64.6%（95%CI=0.436～0.665）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，膀胱癌病人3年生存期的AUC為0.652（圖3C、D）。

2.5獨立預(yù)后驗證

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，病人腫瘤分期（HR=1.763，95%CI=1.236～2.515，P<0.01）、腫瘤浸潤深度（HR=1.695，95%CI=1.152～2.495，P<0.01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=1.531，95%CI=1.165～2.013，P<0.01）和模型風(fēng)險評分（HR=1.828，95%CI=1.438～2.324，P<0.001）與膀胱癌病人預(yù)后相關(guān)。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，風(fēng)險評分（HR=1.933，95%CI=1.457～2.563，P<0.001）可以作為膀胱癌病人預(yù)后的獨立影響因素。見圖4。

火山圖：圖中每一點代表一個自噬基因，其中黑色點代表無差異表達(dá)基因，紅色點代表表達(dá)上調(diào)基因，綠色點則代表表達(dá)下調(diào)基因。B為GO富集分析：圖中形狀的大小代表富集基因的數(shù)量，形狀越大代表富集的基因越多;顏色代表P值的大小，P值越小顏色越紅，反之越藍(lán)（P<0.05）。C為KEGG通路富集分析：圖中每行代表一個生物功能通路，其中方格代表富集于該通路的基因，顏色則代表基因表達(dá)差異的倍數(shù)，顏色越紅代表表達(dá)差異倍數(shù)越大。

A：風(fēng)險模型對于高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的生存預(yù)后分析;B：ROC曲線對風(fēng)險模型預(yù)測準(zhǔn)確性的分析結(jié)果;C：風(fēng)險模型對于GEO數(shù)據(jù)集中高低風(fēng)險組的生存預(yù)后分析;D：風(fēng)險模型對于GEO數(shù)據(jù)集分析結(jié)果準(zhǔn)確性分析。

3討論

一般情況下，體內(nèi)的自噬水平一直處于相對平衡的生理狀態(tài)，自噬在腫瘤的發(fā)生、形成和轉(zhuǎn)移的過程中具有重要作用[16]。在腫瘤形成的初期，自噬可以抑制腫瘤的形成。但是在腫瘤形成后，自噬則會促進(jìn)腫瘤生長和侵襲，此時的自噬就會成為腫瘤的促進(jìn)因素[17]。目前，對膀胱癌自噬研究比較局限、單一。本文研究篩選膀胱癌癌旁組織和膀胱癌組織中DEARGs，并探討其生物學(xué)功能。GO富集分析結(jié)果顯示，DEARGs主要與BP（主要包含內(nèi)在凋亡信號通路、神經(jīng)元死亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、自噬和自噬信號通路）、CC（主要包含自噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔體、外膜、線粒體外膜和細(xì)胞器外膜）和MF（主要涉及泛素蛋白連接酶的結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合、BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合及蛋白酶結(jié)合）相關(guān);KEGG分析結(jié)果顯示，DEARGs主要與ALS、細(xì)胞凋亡、凋亡-多物種、膀胱癌、慢性骨髓性白血病、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、內(nèi)分泌的阻力、ErbB信號通路、P53信號通路、PI3K-Akt信號通路和鉑耐藥等通路相關(guān)，這說明膀胱癌DEARGs與癌癥相關(guān)通路及腫瘤耐藥相關(guān)。目前研究認(rèn)為，PI3K-Akt信號通路和鉑耐藥通路相關(guān)，RrbB2可以誘導(dǎo)血管生長并促進(jìn)膀胱癌的轉(zhuǎn)移[18];在膀胱癌中，3-BrPA可以通過抑制P53通路從而有效抑制膀胱癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[19];PI3K-Akt信號通路可以調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)化和侵襲，在浸潤性膀胱癌中已發(fā)現(xiàn)了類似的FGFR3突變[20];DEARGs還與鉑類藥物耐藥相關(guān)，有些膀胱癌病人應(yīng)用此類藥物治療效果不佳，可能與膀胱癌的耐藥機(jī)制相關(guān)[7]。其機(jī)制是否與DEARGs相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本文研究構(gòu)建了含有6個自噬基因（[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3、MYC）的風(fēng)險模型，其中[STBX]DIRAS3和ITGA3可以作為膀胱癌預(yù)后的生物標(biāo)志物[7-8]，MYC可以通過各種機(jī)制促進(jìn)膀胱癌的轉(zhuǎn)移和浸潤[21]。關(guān)于[STBX]SPNS1、APOL1和P4HB基因在膀胱癌中的作用尚不明確，需進(jìn)一步的研究和探索。但已有研究顯示，[STBX]SPNS1與P53信號通路相關(guān)[22]。[STBX]APOL1可以作為胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物[23]。在腎透明細(xì)胞癌中[STBX]P4HB可以作為預(yù)后不良的腫瘤標(biāo)志物[24]。本研究建立的模型可以有效劃分高、低風(fēng)險的病人，預(yù)測結(jié)果也準(zhǔn)確有效，并且該結(jié)果在外部數(shù)據(jù)集中也得到了驗證。該模型的風(fēng)險評分也可作為預(yù)測膀胱癌病人預(yù)后的獨立因素。因此，本文構(gòu)建的自噬基因相關(guān)模型可以篩查高風(fēng)險的膀胱癌病人，提前干預(yù)、治療從而改善病人的預(yù)后。

綜上所述，本文篩選并構(gòu)建了含有以下6個基因[STBX]SPNS1、APOL1、P4HB、DIRAS3、ITGA3和MYC的風(fēng)險模型，該模型可以很好地篩選高風(fēng)險的膀胱癌病人，其風(fēng)險評分還可以作為預(yù)測膀胱癌病人預(yù)后的一個獨立因素。本研究結(jié)果為后期膀胱癌的早期診斷及前期干預(yù)治療，改善病人預(yù)后提供了可靠的理論基礎(chǔ)依據(jù)。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）