謝珊珊 陳爍 葉夢思 王施施 陳華樂

摘要：目的 初步探討亞抑菌濃度（sub-MIC）卡泊芬凈對白念珠菌生物膜形成的影響，為清除生物膜策略的制定提供理論基礎(chǔ)。方法 用微量肉湯稀釋法測定卡泊芬凈對白念珠菌的活性，并研究sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生長的影響；運用菌落計數(shù)、XTT染色和掃描電鏡分析sub-MIC卡泊芬凈作用下形成的白念珠菌生物膜特點；采用實時熒光定量RT-PCR測定Ece1，Can2，Hip1，GAP1，GCN4和Stp2等白念珠菌生物膜相關(guān)基因的mRNA表達水平。結(jié)果 12株白念珠菌對卡泊芬凈的MIC值范圍為0.625～0.875 μg/mL，sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌的生長有不同程度的抑制作用。針對白念珠菌生物膜的形成，1/4 MIC和1/8 MIC卡泊芬凈皆對生物膜中的菌體數(shù)量、菌體代謝活性及生物膜結(jié)構(gòu)有抑制作用，而1/16 MIC卡泊芬凈則對生物膜無明顯影響。1/4 MIC和1/8 MIC卡泊芬凈對白念珠菌生物膜相關(guān)基因的表達水平也具有抑制作用，1/16 MIC卡泊芬凈則對基因表達水平無影響。結(jié)論 sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生物膜的形成有一定抑制作用。但白念珠菌在sub-MIC卡泊芬凈作用下仍能形成生物膜，臨床上需要謹防出現(xiàn)卡泊芬凈處于亞抑菌濃度的情況。

關(guān)鍵詞：白念珠菌；卡泊芬凈；亞抑菌濃度；生物膜

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Influence and mechanism of caspofungin at sub minimal inhibitory concentration on the biofilm formation of Candida albicans

Xie Shan-shan1， Chen Shuo2， Ye Meng-si2， Wang Shi-shi2， and Chen Hua-le2

（1 Central Hospital of Wenzhou， Wenzhou 325000;

2 The Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000）

Abstract Objective To investigate the influence of sub minimal inhibitory concentration （sub-MIC） of caspofungin on the biofilm formation of Candida albicans， which may provide a theoretical basis for the strategies of removing biofilms in the future. Methods Susceptibility testing of C. albicans to caspofungin was determined using the broth microdilution method. Then we studied the impact of caspofungin at sub-MIC on the growth of C. albicans. In addition， colony counting， XTT staining， and scanning electron microscopy were performed to analyze the characteristics of C. albicans biofilms， which were under the action of caspofungin at sub-MIC. In addition， the expression levels of Ece1， Can2， Hip1， GAP1， GCN4， and Stp2 were analyzed by Real-time PCR. Results The MICs of twelve C. albicans strains to caspofungin were in the range of 0.625～0.875 μg/mL. We found that the growth of C. albicans was inhibited by different sub-MICs of caspofungin at varying degrees. As for the biofilm formation of C. albicans， both 1/4 MIC and 1/8 MIC of caspofungin had inhibitory effects on the number， metabolic activity of C. albicans cells within biofilm， and the structure of biofilm， while the biofilm seemed not to be significantly altered by 1/16 MIC of caspofungin. The expression levels of C. albicans biofilm formation-related genes （Ece1， Can2， Hip1， GAP1， GCN4 and Stp2） were significantly decreased when treated with 1/4 MIC or 1/8 MIC of caspofungin， but stayed the same after the treatment of 1/16 MIC caspofungin. Conclusion Sub-MIC of caspofungin had an inhibitory effect on the biofilm formation of C. albicans. However， the biofilm of C. albicans can still be formed under the action of caspofungin at sub-MIC. It is crucial to beware of the subinhibitory concentration of caspofungin， which may occur in clinical practice.

Key words Candida albicans; Caspofungin; Sub minimal inhibitory concentration; Biofilm

白念珠菌是醫(yī)源性感染中最常見的真菌，在抗真菌藥物使用的情況下，侵襲性念珠菌病病死率仍可高達40%左右[1-2]。白念珠菌的生物膜形成能力可使其耐藥性提高100～1000倍，是常規(guī)藥物治療醫(yī)源性感染失敗的重要原因[3-4]?？ú捶覂羰且环N棘白菌素類抗真菌藥物，研究顯示它對大多數(shù)侵襲性念珠菌病的治療均能取得良好的效果，且相較兩性霉素B、氟康唑等，有不良反應(yīng)輕、生物利用度等優(yōu)勢[5-6]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)體外膜肺氧合，體內(nèi)的炎癥反應(yīng)等因素均會降低卡泊芬凈有效濃度，導(dǎo)致血藥濃度處于亞抑菌濃度（sub-MIC）[7-8]。本文旨在通過提高對sub-MIC抗菌藥物對白念珠菌生物膜形成作用的認識，為今后清除生物膜策略的制定提供理論基礎(chǔ)。

本研究以臨床分析的白念珠菌為研究對象，通過微量肉湯稀釋法測定卡泊芬凈對白念珠菌的活性，并研究sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌的生長曲線及生物膜形成能力的影響。同時通過實時熒光RT-PCR檢測Ece1，Can2，Hip1，GAP1，GCN4和Stp2等基因mRNA的表達水平，初步探討sub-MIC抗菌藥物對白念珠菌生物膜的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

本研究收集2018年1月—2019年6月溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院臨床分離的白念珠菌共11株（分別為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、V1、V2和V3），剔除了同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株。所有菌株經(jīng)Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定，確定為白念珠菌。白念珠菌標準株DAY185野生型（WT）為質(zhì)控菌株。

1.2 儀器和試劑

Vitek全自動細菌鑒定儀（法國梅里埃公司）；熒光定量PCR儀（7500 real time PGR system， Applied Biosystems公司）；DR100型比濁儀（法國生物梅里埃公司）；細胞培養(yǎng)板（美國康寧公司）；酶標儀（美國Biotek公司）；掃描電鏡（德國卡爾蔡司公司）；JY96-IIN 超聲波細胞破碎儀（上海滬析實業(yè)有限公司）。細菌總RNA提取裂解液RNAiso Plus trizol（TaKaRa大連有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）；實時熒光定量PCR檢測試劑盒（日本Toyobo SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-）；各種基因檢測所用的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）肉湯培養(yǎng)基，沙保弱氏瓊脂培養(yǎng)基，XTT，吩嗪硫酸甲酯和卡泊芬凈均購自美谷生物科技（浙江）有限公司。

1.3 藥敏試驗

白念珠菌對卡泊芬凈的藥敏試驗方法參照CLSI M27 A3中的微量肉湯稀釋法，每株菌作3個復(fù)孔，24 h后存在肉眼可見的渾濁則結(jié)果判讀為生長陽性。

1.4 生長曲線測定

設(shè)1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC濃度卡泊芬凈為實驗組，卡泊芬凈濃度為0作為對照組。白念珠菌初始接種量為1000 CFU/mL，分別于培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、46和54 h時測取其在530 nm波長處A值，即A530。實驗組與對照組白念珠菌的生長差異△A530=A530實驗組-A530對照組。

1.5 菌落計數(shù)

活化白念珠菌后培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期（24～30 h），

制成106CFU/mL菌懸液后取100μL分別加入終濃度0、1/4、1/8和1/16 MIC濃度卡泊芬凈的細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)6h待其黏附，隨后用PBS洗滌祛除未附著細胞。加入YPD培養(yǎng)基再培養(yǎng)48h，培養(yǎng)24 h時更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程中保持各組培養(yǎng)體系中的卡泊芬凈終濃度分別為0、1/4、1/8和1/16 MIC不變。培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清并用PBS洗滌除去結(jié)合疏松的微生物，戴滅菌手套手動刮取生物膜重懸于含4 mL滅菌水的離心管中進行超聲破碎分離生物膜。超聲破碎參數(shù)為30 s，4次，42 kHz，全程冰浴中操作。最后于沙保弱培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)。

1.6 細胞代謝活性檢測

如上所述培養(yǎng)各組白念珠菌生物膜，隨后加入90 μL 0.75 mg/mL的XTT和10 μL 320 μg/mL的吩嗪硫酸甲酯處理30 min，使用全功能微孔板檢測酶標儀測定450 nm處吸光度反映生物膜中細胞的代謝活性。

1.7 掃描電鏡定性測定生物膜

將包被Na-EDTA血漿的無菌培養(yǎng)皿蓋玻片置于無菌12孔細胞培養(yǎng)板中，加入106 CFU/mL對數(shù)生長期后期的白念珠菌菌液于30℃培養(yǎng)60min待其黏附，隨后用PBS洗滌祛除未附著細胞。再加入1 mL YPD培養(yǎng)基，37℃，50 r/min培養(yǎng)20 h；培養(yǎng)結(jié)束用1 mL 2.5%戊二醛于4℃固定24 h，洗凈后用1%四氧化鋨在室溫處理30 min。乙醇梯度濃度脫水后臨界點干燥；鍍金后用掃描電鏡成像分析。

1.8 實時熒光定量RT-PCR

采用RNeasy Minikit提取及純化各組不同卡泊芬凈作用下培養(yǎng)12 h后的白念珠菌的RNA，NanoDrop分光光度儀測定RNA濃度。實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系如下：DEPC水4.4 μL，SYBR green realtime PCR Master Mix-Plus- 10 μL，Plus Buffer 2 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性15 s，60℃退火60 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min；最后65℃～95℃熔解曲線分析判斷產(chǎn)物的特異性。內(nèi)參基因為18S RNA，目的基因為Ece1，Can2，Hip1，GAP1，GCN4和Stp2，基因表達量差異計算方法為2-△△CT：以Ece1為例，ΔCt（試驗樣本） = Ct （sub-MIC處理樣本Ece1基因） －Ct （sub-MIC處理樣本18S RNA基因），ΔCt （校準樣本） = Ct （0 MIC處理樣本的Ece1基因）－ Ct （0 MIC處理樣本的18S RNA基因），-ΔΔCt=ΔCt（校準樣本）－ΔCt （試驗樣本），2-ΔΔCt即為生物膜相關(guān)基因在sub-MIC處理組菌株的表達量相較于0 MIC處理組菌株的比值。引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計學分析

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，兩樣本間比較采用配對樣本t檢驗，雙側(cè)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白念珠菌對卡泊芬凈的MIC值測定

微量肉湯稀釋法檢測12株白念珠菌對卡泊芬凈的MIC值范圍為0.625～0.875 μg/mL。其中WT為0.75 μg/mL，5株臨床分離株為0.625 μg/mL，4株臨床分離株為0.75 μg/mL，2株臨床分離株為0.85 μg/mL。

2.2 sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生長影響

從8 h開始，sub-MIC卡泊芬凈開始對白念珠菌的生長有影響。當卡泊芬凈濃度為1/4 MIC時，12株白念珠菌在8 h后的各個時間點△A530值中位數(shù)均為負數(shù)，表明白念珠菌的生長受到了抑制。1/8 MIC卡泊芬凈影響下，△A530值中位數(shù)仍為負數(shù)，但相較1/4 MIC作用下，△A530值更接近0?？ú捶覂魸舛冉抵?/16 MIC時，△A530值中位數(shù)已幾乎為0，表明此濃度的卡泊芬凈對白念珠菌已無明顯生長抑制，見圖1。

2.3 sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生物膜中活菌落量影響

1/4 MIC和1/8 MIC卡泊芬凈作用下形成的生物膜中，白念珠菌活菌落數(shù)量較無卡泊芬凈作用下形成的白念珠菌生物膜中明顯減少（P<0.001），但部分菌株的生物膜內(nèi)活菌落數(shù)在這2個不同濃度的卡泊芬凈作用下數(shù)量相近（P=0.088）。而1/16 MIC卡泊芬凈組中，生物膜中白念珠菌活菌落數(shù)量已與無卡泊芬凈作用組中接近持平（P=0.300），見圖2。

2.4 sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生物膜中活菌代謝影響

1/4 MIC和1/8 MIC卡泊芬凈作用下形成的生物膜中，白念珠菌的代謝活性較無卡泊芬凈作用下形成的白念珠菌生物膜中明顯降低（P<0.001）。而1/16 MIC卡泊芬凈組中，生物膜中白念珠菌的代謝活性已與無卡泊芬凈作用組中接近持平（P=0.148），見圖3。

2.5 sub-MIC卡泊芬凈影響下形成的白念珠菌生物膜形態(tài)分析

掃描鏡下可見，無抗菌藥物壓力下形成的白念珠菌形成的生物膜數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)致密，菌體在生物膜內(nèi)部縱橫交織。而在1/4 MIC和1/8 MIC卡泊芬凈作用下形成的白念珠菌生物膜中雖然存在縱橫交織的結(jié)構(gòu)，但數(shù)量明顯減少，且本來致密排列的菌體變得疏松。1/16 MIC卡泊芬凈組中的白念珠菌生物膜在鏡下則是數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)致密，見圖4。

2.6 sub-MIC卡泊芬凈影響下白念珠菌生物膜相關(guān)基因的mRNA表達水平

1/4 MIC和1/8 MIC卡泊芬凈作用下，白念珠菌生物膜相關(guān)基因的表達水平均明顯下降（低于0 MIC組的1/2，P<0.001）。而1/16 MIC卡泊芬凈則對白念珠菌生物膜相關(guān)基因的表達無抑制作用（P= 0.057），見圖5。

3 討論

白念珠菌是最常見的人類真菌病原體，通常定植于皮膚和黏膜表面，但它也可以通過侵入攜帶植入性醫(yī)療設(shè)備的患者體內(nèi)，特別是免疫受損的患者的血液循環(huán)中引起危及生命的全身性感染[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，同三唑類或兩性霉素B組相比，納入卡泊芬凈治療組的患者具有更好的生存率以及臨床治愈率[5]。有觀點認為無論疾病的嚴重程度如何，棘白菌素對大多數(shù)真菌感染患者都是首選治療藥物[1]。但關(guān)于檢出棘白菌素耐藥念珠菌的報道越來越多，其中光滑念珠菌最為常見，其他如白色、熱帶以及克柔念珠菌等也有耐藥的報道，而且非血液分離的念珠菌對棘白菌素的耐藥情況被嚴重低估[10-11]。雖然卡泊芬凈對白念珠菌血液感染的治療臨床效果優(yōu)于阿唑類藥物，但是其臨床經(jīng)驗用藥常由于代謝分布、使用劑量不足導(dǎo)致血藥濃度處于亞抑菌濃度（sub-MIC）。而白念珠菌幾乎能在所有侵入性醫(yī)療設(shè)備上形成生物膜，一旦形成生物膜，病原菌就處于一種被保護的狀態(tài)，并具備了對患者免疫防御系統(tǒng)的高度耐受性[3-4]。目前為止，臨床上還沒有真正有效的針對生物膜的治療方案，唯一的選擇是移除留置的醫(yī)療植入物，而對于一些危重患者，例如新生兒ICU中的低出生體重的早產(chǎn)兒，留置醫(yī)療植入物是生存的必要條件[12-13]。侵襲性念珠菌病的診療現(xiàn)狀十分嚴峻，使白念珠菌生物膜研究成為科研工作者不得不關(guān)注的熱點。

sub-MIC抗菌藥物對病原微生物生物膜的形成具有調(diào)控作用，且調(diào)控作用可因抗菌藥物種類、濃度、作用時間，實驗條件或具體菌株的差異，可能會呈現(xiàn)抑制或誘導(dǎo)等不同結(jié)果[4]。真菌方面，多種sub-MIC抗菌藥物對白念珠菌的表型具有調(diào)節(jié)作用[14-15]。然而，有關(guān)sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生物膜的影響尚缺乏相關(guān)研究。本研究中12株白念珠菌的生長均受到各個sub-MIC卡泊芬凈不同程度的抑制，抑制作用隨著藥物濃度的降低而減弱。當卡泊芬凈濃度為1/16 MIC時，白念珠菌的生長已幾乎不受影響。目前對白念珠菌生物膜形成的研究發(fā)現(xiàn)其整個過程始于酵母細胞在醫(yī)療植入設(shè)備表面的接種和附著[16]，生長曲線顯示不同濃度卡泊芬凈對白念珠菌生長的影響是從8～16 h開始有明顯抑制作用。一般白念珠菌的黏附期約為6 h，筆者進一步對亞抑菌濃度卡泊芬凈作用下白念珠菌生物膜的形成能力做了測定。結(jié)果顯示除1/16 MIC外，不同亞抑菌濃度卡泊芬凈中形成的成熟白念珠菌生物膜中活細胞數(shù)和細胞代謝活性亦有不同程度的減弱，說明卡泊芬凈仍能作用于黏附后的白念珠菌生物膜形成過程。此外，不同于sub-MIC氟康唑能促進白念珠菌菌體聚集[17]，掃描電鏡下筆者發(fā)現(xiàn)與無抗菌藥物壓力下形成的白念珠菌生物膜相比，在亞抑菌濃度卡泊芬凈作用下形成的白念珠菌生物膜中雖然仍存在縱橫交織的結(jié)構(gòu)，但本來致密排列的菌體已明顯變得疏松。筆者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)sub-MIC藥物可以通過抑制生物膜形成相關(guān)基因的表達水平抑制生物膜形成[18]，所以筆者在念珠菌基因組在線數(shù)據(jù)庫（Candida Genome Database，http：//www.candidagenome.org/）中篩選了6個與白念珠菌生物膜形成相關(guān)的基因（Ece1，Can2，Hip1，GAP1，GCN4和Stp2）進行分析。通過實時熒光定量RT-PCR測定其在不同亞抑菌濃度卡泊芬凈影響下的表達水平，筆者發(fā)現(xiàn)除1/16MIC卡泊芬凈組外，另外兩個濃度的卡泊芬凈能顯著抑制白念珠菌形成生物膜的重要黏附基因Ece1的表達水平。此外，其他生物膜形成相關(guān)基因Can2，Hip1，GAP1，GCN4和Stp2的表達水平也均受到除1/16 MIC外的兩個sub-MIC卡泊芬凈的抑制?？梢妔ub-MIC卡泊芬凈作用下，白念珠菌生物膜形成相關(guān)基因表達水平的降低與生物膜形成的減弱的表型相一致。

本研究顯示了sub-MIC卡泊芬凈對白念珠菌生物膜的形成具有抑制作用。但白念珠菌在sub-MIC藥物作用下仍能形成生物膜，因此仍需謹防sub-MIC的情況出現(xiàn)。研發(fā)針對醫(yī)源性感染的新藥投入減少且臨床測試的周期過長，因此提高對sub-MIC抗菌藥物對白念珠菌生物膜形成作用的認識，為今后清除生物膜策略的制定提供理論基礎(chǔ)，從而改善白念珠菌醫(yī)源性感染患者的預(yù)后，可能是一種可行的解決方案。

參 考 文 獻

[1]Kullberg B J， Arendrup M C. Invasive candidiasis[J]. N Engl J Med， 2015， 373（15）： 1445-1456.

[2]Pappas P G， Lionakis M S， Arendrup M C， et al. Invasive candidiasis[J]. Nat Rev Dis Primers， 2018， 4： 18026.

[3]Pereira R， Dos S F R O， de Brito E H S， et al. Biofilm of Candida albicans： Formation， regulation and resistance[J]. J Appl Microbiol， 2020， 13（1）： 11-22

[4]Algburi A， Comito N， Kashtanov D， et al. Control of biofilm formation： Antibiotics and beyond[J]. Appl Environ Microbiol， 2017， 83（3）： e02508-e02516

[5]Andes D R， Safdar N， Baddley J W， et al. Impact of treatment strategy on outcomes in patients with candidemia and other forms of invasive candidiasis： A patient-level quantitative review of randomized trials[J]. Clin Infect Dis， 2012， 54（8）： 1110-1122.

[6]Li Y， Yang J， Li X， et al. The effect of Ginkgolide B combined with fluconazole against drug-resistant Candida albicans based on common resistance mechanisms[J]. Int J Antimicrob Agents， 2020， 56（2）： 106030.

[7]Sutiman N， Koh J C， Watt K， et al. Pharmacokinetics alterations in critically Ill pediatric patients on extracorporeal membrane oxygenation： A systematic review[J]. Front Pediatr， 2020， 8： 260， DOI： 10.3389/fped.2020.00260.

[8]Carcillo J A， Doughty L， Kofos D， et al. Cytochrome P450 mediated-drug metabolism is reduced in children with sepsis-induced multiple organ failure[J]. Intensive Care Med， 2003， 29（6）： 980-984.

[9]Riedi A C，Ramseier F. Regression： Different visions， different responses[J]. Krankenpfl Soins Infirm， 1990， 83（3）： 47-51.

[10]Fraser M， Borman A M， Thorn R， et al. Resistance to echinocandin antifungal agents in the United Kingdom in clinical isolates of Candida glabrata： Fifteen years of interpretation and assessment[J]. Med Mycol， 2020， 58（2）： 219-226.

[11]Arendrup M C and Perlin D S. Echinocandin resistance： An emerging clinical problem？[J]. Curr Opin Infect Dis， 2014， 27（6）： 484-492.

[12]Cornely O A， Bassetti M， Calandra T， et al. ESCMID* guideline for the diagnosis and management of Candida diseases 2012： Non-neutropenic adult patients[J]. Clin Microbiol Infect， 2012， 18 （Suppl 7）： 19-37.

[13]Mellinghoff S C， Cornely O A， Jung N. Essentials in Candida bloodstream infection[J]. Infection， 2018， 46（6）： 897-899.

[14]Asghar F， Yan H， Jiang L. The putative transcription factor CaMaf1 controls the sensitivity to lithium and rapamycin and represses RNA polymerase III transcription in Candida albicans[J]. FEMS Yeast Res， 2018， 18（6）， DOI： 10.1093/femsyr/foy068.

[15]Sharma Y， Rastogi S K， Perwez A， et al. Beta-citronellol alters cell surface properties of Candida albicans to influence pathogenicity related traits[J]. Med Mycol， 2020， 58（1）： 93-96.

[16]Gulati M， Nobile C J. Candida albicans biofilms： Development， regulation， and molecular mechanisms[J]. Microbes Infect， 2016， 18（5）： 310-321.

[17]Mores A U， Souza R D， Cavalca L， et al. Enhancement of secretory aspartyl protease production in biofilms of Candida albicans exposed to sub-inhibitory concentrations of fluconazole[J]. Mycoses， 2011， 54（3）： 195-201.

[18]Chen H， Cao J， Zhou C， et al. Biofilm formation restrained by subinhibitory concentrations of tigecyclin in Acinetobacter baumannii is associated with downregulation of efflux pumps[J]. Chemotherapy， 2017， 62（2）： 128-133.