白吉林 ，張權(quán) ，張志龍 ，張墨軒 ，劉偉 ，張健

1 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；2 臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科

膠質(zhì)瘤是指起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，81%顱內(nèi)惡性腫瘤為膠質(zhì)瘤［1］。根據(jù)WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，膠質(zhì)瘤分成Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤。在原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM，WHO Ⅳ級）的發(fā)病率最高，約占46.1%；預(yù)后最差，中位總生存期僅12～15 個月［2］。膠質(zhì)瘤目前尚無根治方法，由于其具有浸潤性生長的特點(diǎn)，常與周圍正常腦組織邊界不清，手術(shù)治療常無法徹底切除，需要輔助放療、化療、免疫治療、靶向治療等手段，以延長患者生存期和提高患者生存質(zhì)量［3］。因此，深入研究膠質(zhì)瘤相關(guān)的分子靶點(diǎn)及其信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)行有針對性的靶向治療對于提高膠質(zhì)瘤患者的生存期具有重要意義。Discs大同源相關(guān)蛋白5（DLGAP5）也稱為肝癌上調(diào)蛋白（HURP），是DLGAP家族成員之一，是一種細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有促進(jìn)微管聚合和促進(jìn)紡錘體形成的功能［4］。DLGAP5 是基因編碼的一種細(xì)胞周期調(diào)控的微管相關(guān)蛋白，作為Ran GTPase 效應(yīng)子，參與有絲分裂著絲粒纖維的穩(wěn)定調(diào)控［5］。 既往研究表明，DLGAP5 在肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、直腸癌中具有明顯促進(jìn)腫瘤生長的作用［6-8］。但是，DLGAP5 在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用尚不清楚。為此，本研究對DLGAP5在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其預(yù)后意義進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2010 年 7 月—2016 年 7 月在臨沂市人民醫(yī)院行膠質(zhì)瘤切除術(shù)患者65 例，男34例、女 31 例，年齡 2～70 歲、平均年齡 44 歲。腫瘤位置：額葉 31 例，顳葉 24 例，其他 10 例；腫瘤大?。洪L徑＜5 cm 31 例，≥5 cm 34 例；WHO 分級：Ⅰ、Ⅱ級 26例，Ⅲ、Ⅳ級 39 例；p53 分型：野生型 36 例，突變型29 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有病例術(shù)前未進(jìn)行放化療、免疫治療等；②所有病例具有手術(shù)指征，且自愿手術(shù)；③所有病例經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他部位惡性腫瘤或者二次手術(shù)者；②病例資料已缺失者；③圍術(shù)期死亡者。本研究已獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會準(zhǔn)許，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 膠質(zhì)瘤DLGAP5蛋白表達(dá)檢測

1.2.1 DLGAP5 表達(dá)定性檢測 采用免疫組化法。將65 例患者癌旁組織及膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，以3 μm 厚度切片，70 ℃烘烤40 min，石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，檸檬酸修復(fù)液中抗原修復(fù)，在冷卻至室溫后移至濕盒中，滴加過氧化物酶阻斷劑，PBS沖洗，加入1∶200稀釋DLGAP5抗體（Affinity，China），4 ℃孵育過夜后PBS漂洗。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液和抗鼠/兔IgG二抗在室溫下孵育30 min，加入少量二甲基苯胺顯色5 min，流水沖洗，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯固定，石蠟封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒即判定為DLGAP5陽性細(xì)胞。每個切片隨機(jī)選取10個視野，對每個視野中DLGAP5陽性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度水平進(jìn)行評分，取平均值。染色強(qiáng)度評分：使用0、1、2、3分依次代表染色程度陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性；DLGAP5陽性細(xì)胞占比評分：視野中無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞低于25%為1分，陽性細(xì)胞25%~50%為2分，陽性細(xì)胞大于50%為3分。以染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞占比評分綜合判斷陽性表達(dá)，二者評分乘積≥1時評定為DLGAP5 陽性表達(dá)，其中DLGAP5 低表達(dá)為評分≤4分、DLGAP5高表達(dá)為評分＞4分。觀察結(jié)果由2名資深病理科醫(yī)生雙盲獨(dú)立閱片判定。

1.2.2 DLGAP5 表達(dá)定量檢測 采用Western blotting法。在65例患者癌旁組織及膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中隨機(jī)抽取10 例癌旁組織及30 例膠質(zhì)瘤組織（Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤15 例，Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤15 例）。將膠質(zhì)瘤組織在液氮作用下研磨，全蛋白提取試劑混勻后提取總蛋白，二喹啉甲酸試劑盒在酶標(biāo)儀下測定各級別膠質(zhì)瘤蛋白濃度。于10% SDS-PAGE 中進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入 1∶2 000 稀釋 DLGAP5 抗體（Affinity，China），放置4 ℃過夜孵育PBST 洗膜，加入抗兔酶標(biāo)記二抗（Cell signaling，USA），搖床孵育 1 h，PBST 洗膜 3 次，吸取 ECL 超靈敏型檢測試劑均勻滴于PVDF 膜上進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，觀察DLGAP5 表達(dá)。每例標(biāo)本檢測均重復(fù)3 次以上，取平均值。

1.3 DLGAP5 表達(dá)與預(yù)后關(guān)系分析 所有患者出院后通過電話定期聯(lián)系或患者自行門診復(fù)查隨訪，隨訪截至2021年7月，統(tǒng)計術(shù)后生存率，比較膠質(zhì)瘤組織DLGAP5不同表達(dá)患者生存率的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用方差分析或χ2檢驗(yàn)。對DLGAP5表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行單因素和多因素分析，使用Kaplan-Meier 法繪制DLGAP5 不同陽性表達(dá)患者的生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLGAP5 定性表達(dá) 免疫組化檢測顯示，膠質(zhì)瘤組織65例份，DLGAP5均為陽性表達(dá)，其中高表達(dá)37例份，低表達(dá)28例份。WHO分級Ⅰ、Ⅱ級26例份，DLGAP5高表達(dá)10例份，高表達(dá)率為38.5%；Ⅲ、Ⅳ級39例份，DLGAP5高表達(dá)27例份，高表達(dá)率為69.2%；不同WHO分級膠質(zhì)瘤組織DLGAP5表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。癌旁組織未見DLGAP5陽性表達(dá)。見圖1。

圖1 DLGAP5 分別在癌旁組織和WHO Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中免疫組化表達(dá)（×400）

2.2 DLGAP5 定量表達(dá) 癌旁組織、膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ～Ⅳ級組織DLGAP5相對表達(dá)量分別0.102±0.004、0.309 ± 0.237、1.108 ± 0.237，癌旁組織、膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ～Ⅳ級組織DLGAP5 相對表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 癌旁組織和WHO Ⅰ～Ⅳ膠質(zhì)瘤組織DLGAP5蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 DLGAP5 表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同WHO 分級及不同類型p53 表達(dá)患者DLGAP5 表達(dá)比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.05），不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置患者DLGAP5 表達(dá)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）。見表1。

表1 DLGAP5表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系［例（%）］

2.4 膠質(zhì)瘤患者DLGAP5表達(dá)的影響因素 Logistic回歸分析顯示，WHO 分級、p53 分型是膠質(zhì)瘤患者DLGAP5表達(dá)的獨(dú)立影響因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 膠質(zhì)瘤患者DLGAP5表達(dá)影響因素的Logistic回歸分析

2.5 DLGAP5 表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪（45.153 ± 31.232）個月，隨訪期間無失訪患者，死亡33例，存活32例，存活率為49.2%。其中，膠質(zhì)瘤組織DLGAP5 高表達(dá)患者生存率為29.7%（11/37），DLGAP5 低表達(dá)患者生存率為75.0%（21/28），DLGAP5 高表達(dá)患者生存率低于其低表達(dá)患者（P＜0.01）。膠質(zhì)瘤中DLGAP5 不同表達(dá)患者生存曲線見圖3。

圖3 膠質(zhì)瘤DLGAP5不同表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

膠質(zhì)瘤是臨床最為常見的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，具有復(fù)發(fā)率高、侵襲性強(qiáng)、生存時間短和病死率高等特點(diǎn)。目前，膠質(zhì)瘤主要依靠CT和MRI等影像學(xué)檢查進(jìn)行初步診斷，治療方式以手術(shù)切除腫瘤為主，并結(jié)合放療和（或）化療等綜合性治療［9］。2021 版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，膠質(zhì)瘤分級標(biāo)準(zhǔn)的更新和修改主要是以分子病理為主，改變了基于組織病理和顯微鏡分級的舊原則，將分子亞分型用于腫瘤的分類。但是，決定膠質(zhì)瘤異質(zhì)性的分子標(biāo)志物較復(fù)雜，不可能通過幾個基因的改變而對腫瘤產(chǎn)生決定性影響［10-11］；而且細(xì)胞中信號通路互相連接，單一藥物治療患者較難出現(xiàn)有效反應(yīng)。因此，聯(lián)合療法改善腫瘤內(nèi)環(huán)境、殺傷腫瘤細(xì)胞仍是目前最有效的治療方式［12］。

近年來，高通量測序技術(shù)和基因芯片技術(shù)的發(fā)展推動了分子革命，為癌癥生物學(xué)分子機(jī)制的研究提 供 了 前 所 未 有 的 機(jī) 遇［13］。 DLGAP5 又 稱 為HURP、DLG7 等，位于染色體 14q22.3 區(qū)域，編碼的蛋白質(zhì)主要由805 個氨基酸殘基構(gòu)成，定位于紡錘體［5］；DLGAP5 的保守 N 端結(jié)構(gòu)域可以與微管結(jié)合，具有促進(jìn)微管聚合和促進(jìn)紡錘體形成的功能，參與有絲分裂著絲粒纖維的穩(wěn)定調(diào)控［14］。DLGAP5 水平與細(xì)胞周期有關(guān)，可在有絲分裂早期持續(xù)高表達(dá)而在后期逐漸下降，主要影響細(xì)胞周期G2/M 期細(xì)胞［15］。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中DLGAP5 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及晚期結(jié)直腸癌分期有關(guān)，DLGAP5 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致結(jié)直腸癌的侵襲和遷移能力下降［16］。另有研究顯示，在肝癌組織中DLGAP5過表達(dá)，同時促進(jìn)了肝腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和黏附［17］，這一現(xiàn)象在DLGAP5 表達(dá)下降后消失；相較于正常組織，肝癌組織中DLGAP5 啟動子甲基化顯著降低，猜測DLGAP5 在肝癌中的差異表達(dá)可能與DLGAP5 基因啟動子的甲基化水平有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中存在多個影響腫瘤生長的蛋白因子。LMNB1、DLGAP5 在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤和GBM 中存在高表達(dá)，DLGAP5在膠質(zhì)瘤前神經(jīng)亞型、IDH1野生型患者中存在高表達(dá)，提示DLGAP5 可能在不同分子亞型膠質(zhì)瘤中發(fā)揮不同作用，LMNB1、DLGAP5可能是膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵標(biāo)志物分子。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中DLGAP5陽性表達(dá)遠(yuǎn)高于其癌旁組織，DLGAP5 表達(dá)與不同WHO 分級和p53不同類型相關(guān)，WHO 分級和p53分型是影響膠質(zhì)瘤患者DLGAP5 表達(dá)的獨(dú)立危險因素，DLGAP5 高表達(dá)患者術(shù)后生存時間明顯縮短。在腫瘤組織中，DLGAP5 表達(dá)與 p53 分型有關(guān)［18］，DLGAP5 過表達(dá)可以通過增加MDM2 介導(dǎo)的泛素化和蛋白酶體降解，降低p53野生型蛋白的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。在卵巢癌中，下調(diào)DLGAP5表達(dá)后可發(fā)生G2/M期細(xì)胞阻滯和凋亡，顯著抑制細(xì)胞增殖［15］；此時，CDK1、Cyclin 和 Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，Bax 表達(dá)增加；而在DLGAP5 顯著上調(diào)后，抗凋亡因子增多，惡性腫瘤增殖加快，卵巢癌患者預(yù)后變差。研究顯示，敲除DLGAP5與多西他賽對抑制細(xì)胞增殖有強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)［19］，DLGAP5在穩(wěn)定多西他賽對紡錘體形成和微管攻擊方面有獨(dú)特作用，在這兩種因素作用下，腫瘤細(xì)胞增殖則停滯于有絲分裂中期。

綜上所述，DLGAP5 在膠質(zhì)瘤中組織中過表達(dá)，DLGAP5 表達(dá)程度與腫瘤組織 WHO 分級、p53 分型以及患者生存時間有關(guān)，提示DLGAP5 有可能成為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的新型生物學(xué)標(biāo)志物。但是，關(guān)于DLGAP5 在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的信號通路及具體機(jī)制還需要進(jìn)行更深入的研究。