段 奕，倪昌雯，王敏華，孫素姣，黃 玲*

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

人體皮膚日常接觸的陽(yáng)光中含有大量的紫外線（ultraviolet，UV），主要由長(zhǎng)波紫外線UVA（320～400 nm）和中波紫外線UVB（280～320 nm）組成〔1〕。其中UVB 是造成皮膚光損傷的主要成分，其能量較高，能作用于皮膚表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，被DNA直接吸收并生成環(huán)丁烷嘧啶二聚體等光合物，導(dǎo)致DNA 損傷〔2-4〕。細(xì)胞在DNA 受損后將阻滯細(xì)胞周期，啟動(dòng)DNA 修復(fù)可使DNA 恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)〔5〕。若修復(fù)效率較低，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞將通過(guò)激活半胱氨酸蛋白酶家族（cysteine-dependent aspartate-specific protease，Caspase），進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5-6〕。同時(shí)，UVB 還可使細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重細(xì)胞損傷。ROS 能破壞細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)并引發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而破壞蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和線粒體等的結(jié)構(gòu)，激活細(xì)胞的死亡受體途徑，加重細(xì)胞損傷和凋亡〔7-8〕。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受高度調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，目的是清除DNA 受損的細(xì)胞〔9〕。避免受損細(xì)胞過(guò)多時(shí)，部分未修復(fù)的受損細(xì)胞未被清除發(fā)生突變，導(dǎo)致光線性皮膚疾病和皮膚癌的發(fā)生〔10〕。為減少紫外線引起的皮膚損傷，開發(fā)具有抗氧化、抗炎和抗細(xì)胞凋亡特性的生物活性藥物非常重要。大量研究發(fā)現(xiàn)一些天然物質(zhì)（如黃酮類化合物）可用于預(yù)防和治療由UVB 引起的皮膚疾病〔11〕。黃酮類化合物是一類多酚類化合物，具有抗氧化、殺菌和抗炎等特性〔12〕。7-羥基異黃酮是從天然植物中分離出的異黃酮類單體，異黃酮類是黃酮類化合物的6 個(gè)主要亞類之一，具有與黃酮類化合物相似的生物學(xué)特性〔13〕。7-羥基異黃酮在異黃酮類化合物中為化學(xué)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單的分子，分子式為C15H10O3。目前發(fā)現(xiàn)，7-羥基異黃酮在體外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制手足口病相關(guān)病毒的活性，可進(jìn)一步用于藥物研發(fā)〔14〕。但對(duì)7-羥基異黃酮在預(yù)防和治療其他疾病的研究較少。為擴(kuò)大異黃酮類化合物的應(yīng)用范圍，本實(shí)驗(yàn)研究了7-羥基異黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和UVB 引起的細(xì)胞光損傷的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑7-羥基異黃酮（批號(hào)：OTV000035，美國(guó)Sigma-Alderich 公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：D8371，美國(guó)Sigma-Alderich 公司）；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：25200056，美國(guó)Sigma-Alderich 公司）；胎牛血清（FBS，批號(hào)：04-002-1A，德國(guó)VivaCell 公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，批號(hào)：8120494，美國(guó)Gibco公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：8120311，美國(guó)Gibco 公司）；青/鏈霉素/兩性霉素B（批號(hào)：03-033-1B，以色列BI 公司）；CCK-8 試劑盒（批號(hào)：IN08-1000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔二抗（批號(hào)：SA00001-2，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；RIPA 裂解液（批號(hào)：R0010，北京索萊寶科技有限公司）；ROS 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CA1410，北京索萊寶科技有限公司）；抗Caspase-8（批號(hào)：ab32397，英國(guó)Abcam 公司）；抗裂解PARP1兔單克隆抗體（批號(hào)：ab32064，英國(guó)Abcam 公司）；抗Beta-actin 兔單克隆抗體（批號(hào)：ac026，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：MP206，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；膜再生液（TBST，批號(hào)：SW3020，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器3111 細(xì)胞培養(yǎng)箱、1300-A2 生物安全柜、Micro 17R 低溫超高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司）；SS-04A 紫外線光療儀、UVB 輻照度監(jiān)視器（上海希格瑪公司）；Biotek Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰公司）；垂直電泳儀、電泳槽（美國(guó)伯樂(lè)公司）；5200Multi 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT 細(xì)胞（批號(hào)：KCB200442YJ）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明野生動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS 和1% 青/鏈霉素/兩性霉素B），在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)至T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的70%～90% 時(shí)進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HaCaT 細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與UVB 照射實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組未經(jīng)任何處理；實(shí)驗(yàn)組分為7-羥基異黃酮組（以下簡(jiǎn)稱“藥物組”）、UVB 照射組（以下簡(jiǎn)稱“UVB 組”）及用7-羥基異黃酮預(yù)處理的UVB 照射組（以下簡(jiǎn)稱“藥物+UVB 組”）。7-羥基異黃酮用DMSO 溶解后，－20 ℃保存。UVB 照射方法：用紫外線光療儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行UVB 照射，照射距離25 cm，并用UVB 輻照度監(jiān)視器監(jiān)測(cè)輻照劑量。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和公式：UVB 照射劑量=照射時(shí)間×UVB強(qiáng)度，設(shè)定UVB 照射強(qiáng)度為30 mJ/cm2，照射時(shí)長(zhǎng)根據(jù)監(jiān)視結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。照射前去除培養(yǎng)基并用少量PBS 覆蓋，避免細(xì)胞干燥。照射結(jié)束后根據(jù)需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或更換DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h 再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞增殖活性將HaCaT 細(xì)胞按6×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板并培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度的7-羥基異黃酮溶 液（6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00，400.00，800.00 μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。24 h 后去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含CCK-8 的無(wú)血清培養(yǎng)基（體積比為1∶10），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔于450 nm 處的吸光度（OD）值，計(jì)算用于表示細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=［（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD 值）］×100%。（空白組內(nèi)不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)，僅有無(wú)血清培養(yǎng)基和CCK-8）

2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè)將HaCaT 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔板內(nèi)并培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后加入200 μmol/L 7-羥基異黃酮處理24 h，再經(jīng)UVB 照射。照射結(jié)束后吸除PBS，每孔加入500 μL 含二氯熒光黃雙乙酸鹽（dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA）的檢測(cè)液（用無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶1 000 稀釋DCFH-DA，使其濃度為10 μmol/L），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，使用酶標(biāo)儀在488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Caspase-8 及PARP1 的表達(dá)將HaCaT 細(xì)胞接種于3.5 cm 平皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞50%～60% 融合后加入200 μmol/L 7-羥基異黃酮處理24 h，經(jīng)UVB 照射后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞并加入含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解緩沖液，置冰上裂解20 min；4 ℃下13 000 r/min 離心15 min，取上清液，用BCA 試劑盒測(cè)定上清液蛋白濃度。用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離約20 μg 蛋白并轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉60 min。將膜分別與抗Caspase-8（1∶1 000）、聚ADP-核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase，PARP1）（1∶1 000）或Beta-actin（1∶5 000）孵育，4 ℃過(guò)夜，次日用TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。與各自種屬特異性的二抗室溫孵育60 min，TBST 緩沖液洗滌3次，每次10 min。使用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，并用成像儀拍照以觀察蛋白表達(dá)。使用Image J 軟件分析蛋白條帶，Beta-actin 作為內(nèi)參。將待測(cè)的蛋白條帶導(dǎo)入Image J 軟件，修改圖片為8-bit 格式的灰度圖片，調(diào)整曝光，消除圖片背景影響。設(shè)置測(cè)量指標(biāo)和單位，分別框選待測(cè)條帶中的各個(gè)泳道，通過(guò)測(cè)量積分光密度得出灰度值。該值即為可視化蛋白表達(dá)量。將測(cè)量出的目標(biāo)蛋白灰度值除以對(duì)應(yīng)泳道的內(nèi)參蛋白灰度值，得到目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，不同組間的比較使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度7-羥基異黃酮對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖活性的影響不同濃度的7-羥基異黃酮對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖活性的影響存在差異，濃度為6.25、12.50、100.00、200.00、400.00 μmol/L 時(shí)7-羥基異黃酮對(duì)HaCaT 細(xì)胞的增殖活性影響顯著，細(xì)胞存活率均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。上述濃度處理的細(xì)胞存活率分別為：136.3%±6.7%、132.0%±15.6%、143.2%±10.2%、186.2%±11.8%、148.6%±10.1%。7-羥基異黃酮濃度在100～400 μmol/L 時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖活性影響最為顯著，200 μmol/L 時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)到峰值，當(dāng)濃度增加到800.00 μmol/L 則顯著抑制細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞存活率為33.0%±4.8%。見圖1。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇7-羥基異黃酮濃度為200 μmol/L。

圖1 不同濃度7-羥基異黃酮對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

3.2 7-羥基異黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響DCFH-DA 是一種熒光探針，它在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)脫乙酰過(guò)程后可被細(xì)胞內(nèi)ROS 氧化生成熒光產(chǎn)物。在特定波長(zhǎng)下對(duì)生成物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)可以反映出細(xì)胞的ROS 生成量。與對(duì)照組相比，藥物組中的ROS 生成量降低（P＜0.01）；UVB 組中的ROS 生成量顯著升高（P＜0.01）。UVB 組與藥物+UVB 組比較發(fā)現(xiàn)，藥物+UVB 組的ROS 生成量較UVB 組明顯下降（P＜0.01）。見圖2。

圖2 7-羥基異黃酮對(duì)細(xì)胞ROS 生成量的影響

3.3 7-羥基異黃酮對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP1 和Caspase-8 的影響與對(duì)照組相比，藥物組中Caspase-8 蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化（P＞0.05），PARP1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；UVB組PARP1 和Caspase-8 蛋白相對(duì)表達(dá)量都顯著升高（P＜0.01）。藥物+UVB 組與UVB 組比較，Caspase-8蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），PARP1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）。見圖3。

圖3 7-羥基異黃酮對(duì)PARP1 和Caspase-8 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及多種途徑，例如生成大量ROS、激活細(xì)胞表面死亡受體及DNA 損傷。過(guò)度暴露于UVB 會(huì)損傷表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，使蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)膜和許多其他重要分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致皮膚發(fā)生曬傷、炎癥、增生、皮膚老化和皮膚癌等多種病理變化。天然植物的活性成分，具有紫外線吸收、抗氧化和抗炎等特性，可作為天然的光保護(hù)劑，用于預(yù)防和減少紫外線對(duì)皮膚的損害〔15〕。既往許多研究報(bào)道，黃酮類化合物如木犀草素、兒茶素和原花青素C1 等均具有較好的抗氧化作用，并且能減少UVB 對(duì)皮膚的損傷，提供光保護(hù)作用。對(duì)于抗UVB 光損傷的藥物仍處于研究階段，目前暫無(wú)法選擇合適的陽(yáng)性藥物作為對(duì)照，為豐富抗UVB 光損傷的藥物，我們對(duì)7-羥基異黃酮進(jìn)行了研究。通過(guò)在UVB 照射前用7-羥基異黃酮預(yù)處理HaCaT 細(xì)胞，觀察該藥物對(duì)HaCaT 細(xì)胞的增殖活性和UVB 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)作為天然異黃酮類提取物的7-羥基異黃酮，在適宜濃度下能促進(jìn)正常HaCaT 細(xì)胞增殖，抑制UVB 照射后細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生，并有效抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。減少UVB 對(duì)細(xì)胞的損傷，為細(xì)胞提供光保護(hù)作用。

細(xì)胞在生理狀態(tài)下可產(chǎn)生一定量的ROS，而機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)，能拮抗ROS 的作用，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。當(dāng)UVB 照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或照射劑量過(guò)高時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，對(duì)細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)造成損傷。據(jù)報(bào)道，約50%由UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過(guò)ROS 水平升高引起的〔16〕。同時(shí)，ROS 介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，促使細(xì)胞發(fā)生大量凋亡〔17-18〕。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HaCaT 細(xì)胞在生理狀態(tài)下可產(chǎn)生ROS，由于抗氧化系統(tǒng)的作用，使細(xì)胞處于氧化還原穩(wěn)態(tài)中。用7-羥基異黃酮處理的細(xì)胞ROS 生成量下降，提示7-羥基異黃酮可使細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)維持在較低的狀態(tài)，減輕機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的壓力。暴露于UVB 中的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量ROS，破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)，損傷細(xì)胞。與未加7-羥基異黃酮的UVB 照射組相比，使用7-羥基異黃酮預(yù)處理的細(xì)胞中ROS 生成量大幅降低，與細(xì)胞生理狀態(tài)下的ROS 水平相近。說(shuō)明7-羥基異黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性，能有效抑制UVB照射前后HaCaT 細(xì)胞中ROS 的生成，尤其是能顯著降低UVB 照射后的ROS 水平。可作為外源性抗氧化劑，降低ROS 對(duì)細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，減少細(xì)胞凋亡。

Caspase 蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，能介導(dǎo)以Caspase-8 為啟動(dòng)子的外源性凋亡和以Caspase-9 為啟動(dòng)子的內(nèi)源性凋亡兩種主要的凋亡途徑〔19〕。有研究報(bào)道，在沒(méi)有死亡受體配體的情況下，UVB 能夠特異性激活Caspase-8，啟動(dòng)外源性細(xì)胞凋亡〔20〕。PARP 是一種核酶，負(fù)責(zé)核酶和染色體蛋白的核糖基化〔21〕。細(xì)胞凋亡后期DNA 鏈的斷裂是激活PARP1 的主要原因。因此，PARP1 在DNA 的修復(fù)和細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。PARP1 作為Caspase 蛋白家族的底物，也是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志物〔22〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UVB 照射后與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Caspase-8 及PARP1 表達(dá)量均上升，說(shuō)明UVB 可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生外源性凋亡，并造成DNA 鏈的斷裂，進(jìn)一步激活PARP1。在UVB 照射前使用7-羥基異黃酮預(yù)處理則發(fā)現(xiàn)Caspase-8 的表達(dá)量明顯降低，提示7-羥基異黃酮可能通過(guò)靶向作用于Caspase-8來(lái)抑制UVB 誘導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡。

使用7-羥基異黃酮預(yù)處理的UVB 照射組中PARP1 蛋白表達(dá)量明顯降低，僅為UVB 組的一半，表明7-羥基異黃酮對(duì)減少UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和DNA 損傷有非常顯著的效果。這可能是由于7-羥基異黃酮一方面能直接保護(hù)細(xì)胞，避免UVB 被DNA 直接吸收使DNA 鏈發(fā)生斷裂。另一方面，7-羥基異黃酮通過(guò)降低UVB 照射后ROS 的生成，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)DNA 的損傷，間接對(duì)細(xì)胞提供保護(hù)作用。綜上所述，7-羥基異黃酮具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞對(duì)UVB 的吸收，降低細(xì)胞內(nèi)ROS 生成和抑制UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等特性，對(duì)細(xì)胞具有光保護(hù)作用，可用于預(yù)防UVB 引起的細(xì)胞損傷。