高月麒，王克華，馬志珺，林 旸，李曉露*，任風(fēng)芝*

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 052165；2.華北制藥集團(tuán)愛(ài)諾有限公司，河北 石家莊 052165)

近年來(lái)，隨著環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)及綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，生物農(nóng)藥在農(nóng)藥領(lǐng)域倍受青睞。阿維菌素類生物農(nóng)藥，因具有選擇性高、低毒無(wú)公害、與環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，受到研究者的重視。伊維菌素為十六元環(huán)結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過(guò)阿維菌素B1a的C22、C23位上的雙鍵加氫還原而成，比阿維菌素結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、安全性更高、持效期更長(zhǎng)[1-2]。伊維菌素由于具有高效、用量少、副作用小等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于牛、馬、豬、羊的肺線蟲(chóng)及胃腸道線蟲(chóng)的治療[3-6]。

隨著公眾對(duì)藥品安全的日益關(guān)注，國(guó)內(nèi)外對(duì)藥物雜質(zhì)的研究越來(lái)越重視，ICH及國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局都相繼發(fā)布了雜質(zhì)研究的指導(dǎo)原則，國(guó)外藥典也對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行了相應(yīng)的規(guī)定。為滿足伊維菌素注冊(cè)需求、與國(guó)際接軌，作者以阿維菌素為起始原料，經(jīng)催化加氫反應(yīng)得到伊維菌素粗品，采用二維色譜純化技術(shù)對(duì)伊維菌素粗品中的關(guān)鍵雜質(zhì)進(jìn)行分離提純，并對(duì)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，擬為伊維菌素的質(zhì)量研究和高端認(rèn)證提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

阿維菌素B1a(純度≥98.5%)，華北制藥集團(tuán)愛(ài)諾有限公司；乙腈，色譜純，Merck公司；甲苯、甲醇，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；純化介質(zhì)(UniSil C18)，蘇州納微科技股份有限公司；純化水，自制。

OptiMax 1001型反應(yīng)釜，梅特勒-托利多公司；高效液相色譜儀(SPD-M20A 型紫外檢測(cè)器)，日本島津公司；二維液相制備系統(tǒng)，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；T-1000型天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；AVANCE Ⅲ-500型核磁共振波譜儀，Bruker公司；LC-MS(ACQUITY UPLC系統(tǒng)，Xevo TQ MS型質(zhì)譜檢測(cè)器，2998型PDA檢測(cè)器，Masslynx工作站)，Waters公司。

1.2 伊維菌素粗品的合成

在反應(yīng)釜中加入甲苯300 mL、阿維菌素B1a原粉100 g，在氮?dú)鈹嚢柘录尤氪呋瘎?.5 g，升溫至70 ℃，通入氫氣進(jìn)行加氫反應(yīng)，反應(yīng)液過(guò)濾、干燥，即得伊維菌素粗品95 g。

1.3 伊維菌素雜質(zhì)的分離純化

將伊維菌素粗品用甲醇溶解，經(jīng)中壓柱(填料UniSil C18，30 μm，1 000 mL)進(jìn)行初分離，洗脫劑為甲醇-水(85∶15，體積比，下同)，根據(jù)洗脫峰分段收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮、干燥，即得高比例的雜質(zhì)粗品。

將雜質(zhì)粗品用甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，采用二維液相制備系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，按照色譜圖出峰分別進(jìn)行目標(biāo)餾分的收集，收集液減壓濃縮、干燥，即得伊維菌素雜質(zhì)純品。

1.4 檢測(cè)條件

制備色譜條件：UniSil C18色譜柱(30 mm×250 mm,10 μm)，洗脫劑為乙腈-甲醇-水(54∶12∶34)，流速為16 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子檢測(cè)，離子源溫度為150 ℃，電離電壓為3.0 kV，電噴霧接口干燥氣(N2)流速為600 L·h-1，錐孔電壓為30 V，脫溶劑氣溫度為350 ℃。

核磁共振條件：樣品用CDCl3溶解，用500 MHz型波譜儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 伊維菌素粗品的HPLC分析(圖1)

由圖1可知，在阿維菌素加氫反應(yīng)過(guò)程中，除生成主產(chǎn)物伊維菌素外，也生成了副產(chǎn)物雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4。

2.2 伊維菌素雜質(zhì)的分離純化

采用二維色譜純化技術(shù)對(duì)伊維菌素粗品中的主要雜質(zhì)進(jìn)行分離提純，得到4個(gè)雜質(zhì)純品，雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4的質(zhì)量分別為35 mg、20 mg、27 mg、45 mg，其色譜純度均大于95%，分別為98.6%、95.7%、97.1%、99.1%。

2.3 伊維菌素雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 質(zhì)譜分析(圖2)

圖2 伊維菌素雜質(zhì)的質(zhì)譜圖

2.3.2 核磁共振波譜分析

13CNMR、1HNMR數(shù)據(jù)分別見(jiàn)表1、表2。

表1 伊維菌素雜質(zhì)的13CNMR數(shù)據(jù)

表2 伊維菌素雜質(zhì)的1HNMR數(shù)據(jù)

2.4 伊維菌素雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

雜質(zhì)1：由ESI+準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z873[M+H]+，m/z890[M+NH4]+；由ESI-準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z871[M-H]-。推定雜質(zhì)1的相對(duì)分子質(zhì)量為872。由核磁共振波譜數(shù)據(jù)可知，雜質(zhì)1的13C化學(xué)位移和1H化學(xué)位移與文獻(xiàn)[7-8]中阿維菌素B1a的一致，確定雜質(zhì)1為阿維菌素B1a。

雜質(zhì)2：由ESI+準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z878[M+NH4]+；由ESI-準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z859[M-H]-，m/z905[M-H+HCOOH]-。推定雜質(zhì)2的相對(duì)分子質(zhì)量為860，較雜質(zhì)1的相對(duì)分子質(zhì)量少12。比對(duì)雜質(zhì)2與雜質(zhì)1的核磁共振波譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)差別在C3′a位碳信號(hào)消失，推測(cè)-OCH3變?yōu)榱?OH；且C22、C23位雙鍵消失，而增加了化學(xué)位移為δ35.88和δ28.20的兩個(gè)碳信號(hào)，說(shuō)明雜質(zhì)2的C22、C23位為飽和鍵。綜上，確定雜質(zhì)2為3′-OH-H2B1a。

雜質(zhì)3：由ESI+準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z748[M+NH4]+；由ESI-準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z729[M-H]-。推定雜質(zhì)3的相對(duì)分子質(zhì)量為730。比對(duì)雜質(zhì)3與雜質(zhì)1的核磁共振波譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)差別在C14a、C15～C20位碳信號(hào)消失；且C22、C23位雙鍵消失，而增加了化學(xué)位移為δ35.90和δ28.21的兩個(gè)碳信號(hào)，說(shuō)明雜質(zhì)3的C22、C23位為飽和鍵。綜上，確定雜質(zhì)3為EP9.0中有關(guān)物質(zhì)H。

雜質(zhì)4：由ESI+準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z894[M+NH4]+；由ESI-準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z921[M-H+HCOOH]-。推定雜質(zhì)4的相對(duì)分子質(zhì)量為876，較雜質(zhì)1的相對(duì)分子質(zhì)量多4。比對(duì)雜質(zhì)4與雜質(zhì)1的核磁共振波譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)差別在C3、C4位雙鍵消失，而增加了化學(xué)位移為δ31.24和δ34.66的兩個(gè)碳信號(hào)，說(shuō)明雜質(zhì)4的C3、C4位為飽和鍵；且C22、C23位雙鍵消失，而增加了化學(xué)位移為δ35.94和δ28.18的兩個(gè)碳信號(hào)，說(shuō)明雜質(zhì)4的C22、C23位為飽和鍵。綜上，確定雜質(zhì)4為EP9.0中有關(guān)物質(zhì)K(H4B1a異構(gòu)體)[9]。

雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

圖3 雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

采用二維色譜純化技術(shù)，從伊維菌素合成產(chǎn)物中分離得到4個(gè)雜質(zhì)，并對(duì)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)與伊維菌素骨架結(jié)構(gòu)一致，均為同系列化合物，其中雜質(zhì)1為阿維菌素B1a，雜質(zhì)2為3′-OH-H2B1a，雜質(zhì)3為EP9.0中有關(guān)物質(zhì)H，雜質(zhì)4為EP9.0中有關(guān)物質(zhì)K(H4B1a異構(gòu)體)。該研究通過(guò)對(duì)伊維菌素合成產(chǎn)物中雜質(zhì)的歸屬研究，為產(chǎn)品的國(guó)內(nèi)外注冊(cè)及進(jìn)入國(guó)際高端市場(chǎng)提供了有力支持，同時(shí)在更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量、保障用藥安全方面具有十分重要的意義。