鄭越，段濤，宋丹，喬琳，陳麗仙，王薇薇*，賓石玉

1(廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林，541061)2(國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京，100037)

植物乳桿菌是目前研究最廣泛的乳酸菌之一，是一種革蘭氏陽性乳桿菌，為兼性異型發(fā)酵，最適生長溫度為30～35 ℃，最適pH為6.5，必須從外界獲取營養(yǎng)物質來滿足自身的生長和新陳代謝的需要，部分菌株能夠還原硝酸鹽，具有抑制假過氧化氫酶活性的能力[1]，常用于食品的發(fā)酵，安全性較高，益生作用明顯。研究表明，植物乳桿菌可以抑制腸道致病菌，HUANG等[2]研究表明，添加植物乳桿菌LDY 2013通過增加小鼠腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量，降低腸桿菌等致病菌數量。萬婧倞等[3]從柏式中喙鯨內臟中篩選出1株植物乳桿菌HJ-S2，能夠有效降低膽固醇，降解率可達48.82%。LIU等[4]從植物乳桿菌TWK 10發(fā)酵的豆奶水提物中分離出具有生物活性的血管緊張肽轉化酶抑制劑，并鑒定出尿嘧啶和甘油組合為血管緊張肽轉化酶抑制劑之一，這表明植物乳桿菌在開發(fā)抗高血壓產品中有巨大潛力。FREDIANSYAH等[5]利用植物乳桿菌FNCC 0027發(fā)酵牙買加櫻桃汁，檢測發(fā)酵底物中多種活性物質，結果表明發(fā)酵后總酚含量、抗氧化活性和對糖尿病相關酶的抑制作用均有所增強。聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《食品益生菌評價指南》指出，對胃酸的耐受性試驗、黏附試驗、對致病菌的抑制試驗等體外試驗是評價益生性微生物安全性的必需試驗[6]。

本課題組前期從健康動物腸道、糞便和土壤中篩選出乳酸菌，經16S rRNA鑒定為植物乳桿菌。本研究通過對實驗室保存的這6株植物乳桿菌的耐酸耐膽鹽能力、模擬胃腸道環(huán)境的耐受性、抑菌活性和黏附性能等益生性能進行評價，以期為其作為益生菌株后期的工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞

菌株來源于課題組自健康仔豬腸道食糜中分離并保存的植物乳桿菌(LP15-1、LP15-2、LC16-1、LP17-1、LP17-3、RS048)。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、鼠傷寒沙門氏菌由國家糧食和物資儲備局科學研究院菌種庫保存。Caco-2、IPEC-1細胞株由中國農業(yè)大學武振龍教授課題組饋贈。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶、胃蛋白酶、20×磷酸緩沖鹽溶液、臺盼藍染色液、異硫氰酸熒光素酯(fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC)，北京索萊寶科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、豬膽鹽，北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉，北京博奧拓達科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶消化液、非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)，美國Gibco公司；二甲基亞砜，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；SynergyH1酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱、BPH-9272精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器，松下健康醫(yī)療器械株式會社；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；微型臺式真空泵，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機，艾本德中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌耐酸能力的測定

參考王祎然等[7]的方法用鹽酸配制pH分別為2.0和3.0的MRS液體培養(yǎng)基，將植物乳桿菌落從凍存管中按照1%接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中，活化2次后，再按照1%接種量接種于不同pH(2.0、3.0)的MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)，在第0、3 h進行活菌平板計數，存活率按公式(1)計算：

(1)

式中：n1為3 h活菌數，n2為0 h活菌數。

1.3.2 植物乳桿菌耐膽鹽能力的測定

參考王祎然等[7]的方法用豬膽鹽配制含0.1%、0.3%(質量分數)膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基，將活化后的植物乳桿菌按照1%接種量接種于不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)，在第0、3 h進行活菌平板計數，存活率計算同1.3.1。

1.3.3 植物乳桿菌耐模擬胃腸道能力的測定

模擬胃液配制[8]：取1 mol/L鹽酸溶液20 mL，加入胃蛋白酶10 g，加水定容至1 000 mL，使其終質量濃度為0.01 g/mL，0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃保存待用。

模擬腸液配制[9]：取KH2PO46.8 g，加水溶解，用NaOH溶液將其pH調至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水溶解后將兩液混合，加水至1 000 mL，并用0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃保存待用。

將活化好的菌液按10%接種量接種到模擬胃液，混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第0、3 h分別取樣，進行活菌平板計數。在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，按照10%接種量接種到模擬腸液，混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第0、3、6 h分別取樣，進行活菌平板計數。存活率計算同1.3.1。

1.3.4 植物乳桿菌致病菌抑制能力的測定

采用牛津杯法[10]測定植物乳桿菌的抑菌能力，分別取4種致病菌(金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99)菌液涂布在LB培養(yǎng)基上，每個平皿中等距放置4個牛津杯，其中3個牛津杯中加入200 μL植物乳桿菌，其余1個作為對照加入200 μL的MRS液體培養(yǎng)基，將平皿正置于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，結束后觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.5 植物乳桿菌黏附性能的測定

細胞培養(yǎng)：Caco-2細胞使用含有雙抗(青霉素100 U/mL和鏈霉素100 g/mL)、10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1%NEAA的DMEM培養(yǎng)基；IPEC-1細胞使用含有雙抗(青霉素 100 U/mL和鏈霉素 100 g/mL)、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液，細胞生長至融合率85%左右，用0.25%胰酶溶液消化后傳代培養(yǎng)，傳代3次后用DMEM完全培養(yǎng)基調整到5×104個/mL接種到24孔板，備用。

植物乳桿菌準備：將活化2次的植物乳桿菌在室溫條件下離心后，收集菌體，用PBS重懸菌體，并調整濃度為1×109CFU/mL，然后加入終質量濃度為100 μg/mL的FITC溶液，37 ℃避光孵育2 h，室溫下離心，棄上清液，用PBS調整植物乳桿菌濃度到1×108CFU/mL，備用。

植物乳桿菌的體外黏附特性測定：參考馮軍廠[11]的方法，24孔板中的細胞長至單層后吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌，并加入無抗培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h后，每孔加入標記的植物乳桿菌菌懸液，避光培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結束后，吸出培養(yǎng)基和菌懸液，用PBS洗滌未黏附的植物乳桿菌，再加胰酶待細胞消化后，加入PBS。將24孔板中的細胞吹打混勻，并加入黑色96孔板，測其熒光值為A1；再取相同量的植物乳桿菌菌懸液，加入胰酶和PBS溶液，混勻后加入黑色96孔板，測其熒光值為A2；取等量胰酶和PBS溶液混勻后加入黑色96孔板，測其熒光值為A0，作為空白對照，各株植物乳桿菌對細胞的黏附率按照公式(2)計算：

(2)

1.4 數據統(tǒng)計

所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示，采用SAS 9.0軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)進行數據統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。若各組間差異顯著，則采用Student-Newman-Keuls多重比較方法檢驗組間差異。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌耐酸能力

植物乳桿菌經過胃腸道，只有抵過胃腸道的強酸和高膽鹽脅迫，在腸道中存活下來，才能在體內發(fā)揮益生作用[12]。人胃液中胃酸的主要成分為鹽酸，其pH通常在3.0，空腹時可達到2.0左右，甚至更低。因此，只有少數耐酸能力較好的植物乳桿菌能夠通過胃酸屏障，以活菌形式到達腸道并發(fā)揮作用。本試驗用不同鹽酸對6株植物乳桿菌生長環(huán)境的pH進行調節(jié)，觀察其在pH 2.0和pH 3.0環(huán)境下培養(yǎng)3 h后的存活情況，結果如表1所示。

如表1所示，pH 3.0條件培養(yǎng)3 h后，6株植物乳桿菌的存活率為80.24%～100.74%，活菌數均高于1×107CFU/mL，這表明這6株植物乳桿菌都具有一定的耐酸能力。其中LP17-1和RS048兩株菌的存活率高于100%表明該菌能在pH 3.0的環(huán)境中繼續(xù)生長，導致其活菌數增加。除此之外的4株菌活菌數均下降，則表明低pH值能抑制植物乳桿菌的生長。pH 2.0條件培養(yǎng)3 h后，6株植物乳桿菌的活菌數均下降，其中3株菌的活菌數<1×103CFU/mL，表明pH 2.0對植物乳桿菌生長抑制能力更強，另外3株菌中LP15-1的存活率為87.96%，顯著高于LP15-2和LC16-1(P<0.05)。

2.2 植物乳桿菌耐膽鹽能力

植物乳桿菌在人體中發(fā)揮益生功能的重要前提是適應小腸中的膽鹽脅迫，人體小腸中膽鹽含量為0.03%～0.3%[13]。本試驗研究了6株植物乳桿菌在膽鹽質量分數為0.1%和0.3%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)3 h后的存活情況，結果如表2所示。

如表2所示，6株植物乳桿菌在0.1%膽鹽培養(yǎng)3 h后，活菌數都在6lgCFU/mL以上，除LC16-1外，其余5株菌的存活率為96.36%～102.47%，說明6株菌都具有較好的膽鹽耐受性。在膽鹽質量分數為0.3%的條件下培養(yǎng)3 h后，6株菌的存活率均有所下降，但LP15-1的存活率為100.03%，顯著高于其他5株，LC16-1和LP17-1活菌數<3lgCFU/mL。由此可知，LP15-1、LP15-2、LP17-3、RS048對膽鹽的耐受能力比較優(yōu)良，其中，LP15-1在膽鹽質量分數為0.1%和0.3%的條件下，存活率分別為102.47%、100.03%，可能是因為該菌耐受膽鹽能力較強，在強膽鹽條件下仍然可以生長。

2.3 植物乳桿菌耐受模擬胃腸液能力

胃腸道中的液體，除了較低的pH值和較高濃度的膽鹽外，還含有胃蛋白酶和胰蛋白酶[14]?！吨袊幍洹穼⑷斯の敢号渲贫槿?.5%～10.5%的稀鹽酸16.4 mL，加水稀釋再加入胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水至1 000 mL即可。人工腸液配制定為取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH為6.8，取胰蛋白酶10 g，加水溶解，將兩液混合后加水定容至1 000 mL即可。研究表明，大多數乳酸菌在pH 1.5 的環(huán)境中，1 h后將會死亡，而在pH 2.5～4.0的環(huán)境中，培養(yǎng)3 h仍有較高的存活率[15-16]。本研究將分離得到的6株植物乳桿菌接種于含有消化酶、pH分別為2.0和3.0的模擬胃液中，進一步考察其存活率。

由表3可知，本次實驗的6株植物乳桿菌在不同pH的模擬胃液中，3 h存活率均高于97%。其中LP15-1存活率最高，在pH 3.0和pH 2.0的模擬胃液中的存活率分別為104.84%和101.13%。

乳酸菌經過胃部的消化后，還需要在腸道中定殖，才能有效發(fā)揮其益生作用[17]。在模擬腸液中，6株植物乳桿菌都表現出較好的耐受腸液能力。除LP15-2和LP17-3以外，3 h內菌株LP15-1、LC16-1、LP17-1、RS048的存活率均能達到100%以上。郝露露等[18]對植物乳桿菌B14、C24、32E在模擬腸道的存活率的研究中，也發(fā)現培養(yǎng)3 h后其存活率能夠達到100%以上，可能是因為試驗菌株為處在對數生長期的旺盛菌株。在模擬腸液中培養(yǎng)6 h，植物乳桿菌的存活率稍有降低，但除LP15-2、LP17-3和RS048外，仍都能夠達到100%以上。因此，本試驗所用的6株植物乳桿菌都具有較強的耐受模擬胃腸液的能力，能夠在胃腸道中有效的發(fā)揮益生作用。

2.4 植物乳桿菌抑菌能力

大量研究表明，乳酸菌在增殖過程中產生的如乳酸、乙酸、細菌素等代謝產物對腸道病原菌具有抑制作用[19]。CIZEIKIENE等[20]發(fā)現乳酸乳桿菌屬和雙歧桿菌屬菌株對大腸桿菌均有抑菌作用，但不同的菌株抑菌能力有差別。YANG等[21]的研究表明乳酸乳球菌能夠有效抑制金黃色葡萄球菌。本研究發(fā)現植物乳桿菌LP15-1、LP15-2、LC16-1、LP17-1、LP17-3、RS048對指示菌金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99均有抑制作用。由表4可知，6株植物乳桿菌對鼠傷寒沙門氏菌的抑制能力比其他3株指示菌強，其中LC16-1對鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑達29.97 mm。植物乳桿菌LP15-1、LC16-1、LP17-1對大腸桿菌的抑制能力顯著高于LP15-2、LP17-3和RS048(P<0.05)，但是6株植物乳桿菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K99的抑制效果的差異不顯著(P>0.05)。

表4 植物乳桿菌對4種指示菌的抑菌圈平均直徑(n=3) 單位：mm

2.5 植物乳桿菌黏附能力

乳酸菌想要在宿主腸道中持久發(fā)揮生理功能的條件之一是能夠在宿主腸道黏膜上皮細胞中黏附并定殖，在腸道某個部位形成穩(wěn)定的菌群后才能發(fā)揮作用[22]，而黏附則被認為是定殖的關鍵一步[23]。目前，體外細胞黏附模型作為評價乳酸菌黏附性的一種最廣泛的手段，被研究者們普遍使用[24]。Caco-2為結腸癌細胞，其優(yōu)點是它們在體外能夠表現出與成熟腸道上皮細胞相似的形態(tài)和功能，因此經常作為評價益生菌黏附能力的體外模型。IPEC-1為豬空腸上皮細胞，用IPEC-1作為模型，能夠模擬乳酸菌對小腸上皮的黏附特性。熒光標記法類似于放射性同位素，該方法常用FITC作為標志物，操作較為簡便，因此，被較多研究者廣泛用于測定乳酸菌的黏附性。

如圖1-A所示，試驗中的植物乳桿菌基本都能夠黏附于Caco-2細胞表面，但表現出的黏附能力有較大差異。LP15-2的黏附率最高，其次是LP15-1，這兩株植物乳桿菌的黏附效果顯著高于其他幾株(P<0.05)。LP17-1黏附率最低。與其他研究[11]相似，本試驗的不同植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力具有較大差異，這種現象可能和菌株的表面特征相關，因此，對黏附能力較好的菌株值得進一步的研究。

從圖1-B可以看出，試驗中的幾株植物乳桿菌對IPEC-1的黏附能力均低于對Caco-2的黏附能力。類似的是，不同菌株對IPEC-1的黏附能力也表現出較大的差異，其中LP15-2的黏附率最高，顯著高于其他5株(P<0.05)。對Caco-2細胞表現出較好的黏附能力的LP15-1對IPEC-1細胞表現出明顯的下降，其黏附率顯著低于LP15-2(P<0.05)，而LP17-1、LP17-3和RS048的黏附率較低，均<0.5%，黏附能力較弱。

A-植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力；B-植物乳桿菌對 IPEC-1細胞的黏附能力圖1 植物乳桿菌對腸道上皮細胞的黏附能力(n=3)Fig.1 Adhesion ability of Lactobacillus plantarum to intestinal epithelial cells(n=3) 注：數值表示平均值±標準差(n=3)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

本試驗采用體外細胞模型模擬腸道上皮細胞，用熒光染料標記來檢測植物乳桿菌的黏附效果。乳酸菌能黏附在黏膜表面過程較為復雜，可能與菌株的胞外多糖、表面蛋白和脂肪酸等有關。從本研究結果可以看出不同菌株在Caco-2細胞表現出較高的黏附性能，可能是乳酸菌主要在后腸段起黏附作用。YU等[25]研究表明，瘤胃乳桿菌菌株GRL1172幾乎無法黏附IPEC-1細胞，對Caco-2細胞有較弱的黏附能力，這與我們得到的結論相似。同時乳酸菌的黏附率也與外界環(huán)境有關，GREENE等[26]研究顯示，低pH值能夠顯著提升乳酸桿菌對Caco-2的黏附能力，劉東方等[27]通過研究菌株的表面疏水性發(fā)現，表面疏水性較高其黏附性能也相對較高，另外蔣建軍等[28]研究發(fā)現Ca2+濃度增加，可以明顯增加乳酸菌的黏附和定殖能力。

3 結論

從不同來源中分離得到的6株植物乳桿菌在耐酸耐膽鹽能力中有所不同，其中植物乳桿菌LP15-1、LP15-2、LC16-1的耐酸能力較強，在pH 2.0的酸環(huán)境中孵育3 h存活率均在43%以上；植物乳桿菌LP15-1、LP15-2、LP17-3和RS048的耐膽鹽能力較好，在0.3%膽鹽培養(yǎng)基中孵育3 h存活率均在72%以上；6株植物乳桿菌均表現出較好的模擬胃腸道耐受性，存活率均高于95%。在抑菌試驗中，6株植物乳桿菌對4種常見的致病菌的抑制能力較好。對Caco-2和IPEC-1細胞的黏附能力差異較大。

對研究結果比較發(fā)現，植物乳桿菌LP15-1具有良好的耐強酸和耐膽鹽能力，在pH 2.0的酸環(huán)境中孵育3 h存活率87.96%，在0.3%膽鹽培養(yǎng)基中孵育3 h 存活率100.03%；且具有較好的模擬胃腸道耐受能力和抑菌能力，對最常用體外細胞模型Caco-2細胞的黏附效果較好，其潛在益生特性有待進一步研究，同時植物乳桿菌LP15-1可作為益生菌在實際生產、功能性食品的開發(fā)、動物飼料中有進一步的應用。其他5株植物乳桿菌的益生特性也各有側重，可根據實際應用中的不同需求對益生特性的優(yōu)勢方面更深一步的探究，以求發(fā)揮其最大作用。