朱麗娟，國果,2*，田竺青，孫朝琴，楊隆兵，黃明嬌，劉鑒，彭建,3，石幫慧

1(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，現(xiàn)代病原生物學(xué)重點特色實驗室，貴州 貴陽，550025)2(貴州醫(yī)科大學(xué)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心， 貴州 貴陽，550025)3(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院，環(huán)境污染監(jiān)測與疾病控制重點實驗室,貴州 貴陽，550025) 4(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

近幾年來，食品中生物性污染問題一直被廣泛關(guān)注。真菌毒素與食品污染息息相關(guān)，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是真菌毒素中較為常見的一種，主要由絲狀真菌黃曲霉產(chǎn)生[1]。1993年黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)被國際癌癥機構(gòu)歸為I類致癌物質(zhì)[2]。調(diào)查顯示，2015—2018年國家市場監(jiān)督管理局報道我國因真菌毒素污染引起的事件高達(dá)602起；在此期間我國出口的食品及飼料中真菌毒素超標(biāo)事件達(dá)241起[3]。食品經(jīng)黃曲霉污染沒有簡便可行的脫毒措施[4]，為延長食品的保質(zhì)期，保障食品安全，人們主要采用生物脫毒法、物理法、化學(xué)法滅活有毒有害微生物，延緩或阻止它的生長[5]。添加防腐劑是最常見的方法，如常見的山梨酸鉀(potassium sorbate,PS)、苯甲酸鈉、雙乙酸鈉等，這些防腐劑或多或少都會對人體健康產(chǎn)生一定的副作用[6]，因而使得許多科研人員對天然安全的抗菌物質(zhì)更為關(guān)注。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類廣泛存在于微生物、動植物及人體內(nèi)的小分子多肽，其抗菌譜廣，具有熱穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生耐藥性、易被人體消化吸收、無毒等優(yōu)點[7]。近年來抗菌肽在食品領(lǐng)域逐漸成為研究熱點并取得了一定的成果[8]。從魚類中分離的抗菌肽Pleurocidin和魚精蛋白，均對單核細(xì)胞增生李斯特菌和其他食品腐敗微生物具有抑制活性，可用于食品保藏[9]。TENEA等[10]從植物乳桿菌UTNGt2中提取的抗菌肽能抑制番茄中的沙門氏菌，延長番茄的保質(zhì)期，顯示了其潛在的防腐潛力。國內(nèi)外公認(rèn)的天然防腐劑——乳酸菌素Nisin是食物防腐保鮮劑的最佳選擇之一[11]。這些都提示了抗菌肽在食品防腐保鮮中有較大的應(yīng)用市場價值。

AMP-17是課題組采用原核表達(dá)體系獲得的重組蛋白，實驗證實其具有顯著的抗菌作用，特別是對白色念珠菌等真菌具有較強的抗菌活性，且熱穩(wěn)定性強，耐反復(fù)凍融，安全性較好，對人和鼠紅細(xì)胞基本沒有溶血性[12-13]。另外還發(fā)現(xiàn)AMP-17能延長草莓的保質(zhì)期，起到保鮮作用[14]。但AMP-17對黃曲霉的生長和產(chǎn)毒有無影響還不得而知。故本研究擬探討AMP-17對食源性真菌黃曲霉的抗菌效果，分析其對黃曲霉菌絲、孢子、產(chǎn)毒等方面的影響，研究結(jié)果為進(jìn)一步了解AMP-17的功能，研發(fā)安全有效的抗菌肽類防腐劑提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

黃曲霉菌株(Aspergillusflavuslink)由貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體(potato dextrose broth medium，PDB)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖固體(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽溶液，北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞濾網(wǎng)(40 μm)，安徽Biosharp公司；AFB1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海佑隆生物科技有限公司；PS(純度>99%)、吐溫-80，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

HVE-50型滅菌鍋，日本ALR公司；X30R冷凍高速離心機，美國BECKMAN公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；IMARK酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；YS100普通光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺，江蘇凈化設(shè)備有限公司；AL104-IC電子天平，上海梅特勒拖利多儀器公司；HITACHI S-3400 N掃描電鏡，日本HITACHI公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 黃曲霉孢子懸液制備

參照BEN TAHEUR等[15]方法并做適當(dāng)修改。取出適量黃曲霉甘油菌，接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃溫箱培養(yǎng)7 d，吐溫-80洗脫固體培養(yǎng)基上的黃曲霉，200 r/min振蕩30 min，收集處理后的洗脫溶液，醫(yī)用紗布過濾，于冷凍離心機離心后，重復(fù)加入無菌水3～5次，得到孢子沉淀物，在將沉淀物重懸在無菌水中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 AMP-17的制備

參考楊隆兵等[16]方法操作獲得抗菌肽AMP-17。

1.4.3 AMP-17對黃曲霉最低抑菌濃度的測定

采用微量液體稀釋法檢測AMP-17對黃曲霉的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[17]。在96孔板中加入100 μL黃曲霉孢子懸液(1.0×104CFU/mL)，再加入一定濃度AMP-17，使其終質(zhì)量濃度為6.25～100 μg/mL。同時以加等體積的無菌水為陰性對照組、100 μg/mL PS為陽性對照組，只加PDB培養(yǎng)液的為空白對照組(下同)。于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置2 d后，肉眼觀察清澈透明的孔所對應(yīng)的藥物濃度即為MIC。

1.4.4 AMP-17對黃曲霉生長曲線的影響

于96孔板中加入孢子懸液及不同濃度AMP-17，置28 ℃培養(yǎng)箱中56 h，每隔8 h檢測630 nm的吸光度值。以時間為X軸，吸光度為Y軸，繪制黃曲霉生長曲線。

1.4.5 AMP-17對黃曲霉孢子萌發(fā)率的影響

將100 μL不同濃度 AMP-17與黃曲霉孢子懸浮液等體積加入96孔板，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h后，取適量菌液充入血球計數(shù)板觀察并計算孢子萌發(fā)率。根據(jù)公式(1)計算孢子萌發(fā)率[18]。

(1)

式中：n1為萌芽孢子數(shù)，n2總孢子數(shù)。

1.4.6 AMP-17對黃曲霉菌絲干重的測定

按照王同等[19]的方法，于20 mL PDB中加入黃曲霉孢子懸液，置28 ℃，150 r/min培養(yǎng)10 h，待孢子完全萌發(fā)后，加入不同濃度的AMP-17，同時加入適量吐溫-80，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，紗布過濾，菌絲體烘干稱重，并按照公式(2)計算AMP-17對菌絲生長的抑制率。

(2)

式中：m1為陰性組菌絲干重，g；m2為實驗組菌絲干重，g。

1.4.7 AMP-17對黃曲霉產(chǎn)AFB1的影響

參考徐楊玉等[20]的方法，將孢子懸液和AMP-17加到10 mL的PDB中，使APM-17終質(zhì)量濃度為25～100 μg/mL。于28 ℃恒溫?fù)u床中，180 r/min培養(yǎng)10 d。根據(jù)AFB1快速檢測試劑盒提供的方法，采用酶聯(lián)免疫法對其毒素積累進(jìn)行定量分析，判斷AFB1積累量。

1.4.8 掃描電鏡觀察AMP-17對黃曲霉形態(tài)的影響

制備黃曲霉電鏡標(biāo)本：將濃度為1×106CFU/mL黃曲霉孢子懸液與50 μg/mL AMP-17混合，取0.2 mL 混合液于PDA培養(yǎng)基上均勻涂布，無菌蓋玻片與培養(yǎng)基水平面45°角插入培養(yǎng)皿中；使得蓋破片與培養(yǎng)基平面接觸面積最大。將PDA培養(yǎng)基置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后。取爬滿黃曲霉菌絲的蓋破片，用2.5%戊二醛固定過夜[21]。經(jīng)不同濃度的乙醇逐級脫水后,將樣品放入臨界點干燥器內(nèi)，干燥后的標(biāo)本置于高真空蒸發(fā)器中，離子噴濺儀噴金后，用S-3400 N掃描電鏡上機觀察。

1.4.9 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

以上實驗每組均處理3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件分析處理結(jié)果，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用單因素方差分析，Tukey′s多重比較分析統(tǒng)計學(xué)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度

本實驗以常用的防腐劑PS作陽性藥物，結(jié)果顯示，AMP-17質(zhì)量濃度≥50 μg/mL的孔內(nèi)清澈透明，即其對黃曲霉的MIC為50 μg/mL。而山梨酸鉀的MIC大于最高質(zhì)量濃度100 μg/mL，提示抗菌肽AMP-17對黃曲霉的抑制效果比山梨酸鉀更為顯著。

2.2 生長曲線

前24 h各組黃曲霉生長速率都較慢，24 h后吸光度值逐漸增高，而低濃度的AMP-17組生長速度亦較快，12.5 μg/mL組與陰性對照生長曲線基本一致。當(dāng)AMP-17質(zhì)量濃度≥50 μg/mL后，生長曲線近乎一條直線，吸光度值無明顯增加，提示在此濃度下黃曲霉生長受到明顯抑制(圖1)。

圖1 黃曲霉生長曲線Fig.1 Growth curve of A.flavus

2.3 黃曲霉孢子萌發(fā)率

培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察到對照組黃曲霉孢子萌發(fā)較好，萌發(fā)率達(dá)94%，經(jīng)AMP-17作用后，各組萌發(fā)率均明顯降低，25 μg/mL AMP-17處理后萌發(fā)率為16.3%，50 μg/mL組萌發(fā)率僅為8%(圖2)。提示AMP-17對黃曲霉的孢子萌發(fā)具有較強的抑制作用。

2.4 對黃曲霉菌絲生長的影響

黃曲霉菌絲體干重可以反映黃曲霉的生長情況，與對照組相比，菌絲體干重越小，說明抑制作用越顯著。圖中對照組黃曲霉形成較多且體積較大的菌絲球，隨著AMP-17作用濃度的增大，菌絲球的數(shù)量越來越少，體積也逐漸減小(圖3-A)，50 μg/mL AMP-17的菌絲體干重約為0.004 67 g，提示對菌絲體抑制率達(dá)72.5%(圖3-B)。令人驚奇的是，經(jīng)PS干預(yù)5 d后反而促進(jìn)了黃曲霉菌絲體的形成(P<0.01)，但在24 h時山梨酸鉀對黃曲霉孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，猜測山梨酸鉀主要是在前期抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，但隨著培養(yǎng)時間的延長，山梨酸鉀對黃曲霉的抑制能力下降并促進(jìn)菌絲的生長發(fā)育。

圖2 AMP-17對黃曲霉孢子萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of AMP-17 on spore germination rate of A.flavus 注：與對照組比較，*表示P<0.05,**表示P<0.01(下同)

A-AMP-17對黃曲霉菌絲球形成的影響；B-AMP-17對 黃曲霉菌體生長的影響圖3 AMP-17對黃曲霉菌絲生長的影響Fig.3 Effect of AMP-17 on the mycelium growth of A.flavus

2.5 對黃曲霉產(chǎn)AFB1的影響

對照組AFB1的量高達(dá)2.189 ng/mL，而25 μg/mL的AMP-17作用后產(chǎn)毒量顯著降低，只有0.056 ng/mL；質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，毒素僅有0.020 ng/mL。而PS則促進(jìn)了黃曲霉產(chǎn)毒(圖4)。說明AMP-17能顯著抑制黃曲霉合成AFB1。

圖4 AMP-17對黃曲霉產(chǎn)AFB1的影響Fig.4 Effects of AMP-17 on AFB1 production by A.flavus

2.6 掃描電鏡觀察黃曲霉結(jié)構(gòu)變化

鏡下觀察到，培養(yǎng)了24 h的正常黃曲菌體細(xì)胞形態(tài)完好且飽滿，孢子梗較多并形成了大量孢子，孢子呈球形，外部光滑，顏色清亮，細(xì)胞之間界限清晰(圖5-A～圖5-C)。經(jīng)AMP-17作用后，黃曲霉不能形成完整的孢子梗，孢子脫離散落，同時表面出現(xiàn)了褶皺、凹陷、破裂、粗糙(圖5-D)，甚至有些細(xì)胞出現(xiàn)碎片，內(nèi)部物質(zhì)流出、菌體形態(tài)發(fā)生部分扭曲變形(圖5-E)，有些菌絲形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重扭曲變形，斷裂成凝絮狀(圖5-F)。結(jié)果表明AMP-17能夠破壞黃曲霉的孢子，菌絲體結(jié)構(gòu)。

A-對照組×500;B-對照組×2 000;C-對照組×5 000； D-AMP-17組×500;E-AMP-17組×2 000;F- AMP-17組×5 000圖5 AMP-17作用于黃曲霉的掃描電鏡觀察Fig.5 SEM of AMP-17 against on A.flavus

3 討論

黃曲霉易污染大豆、花生和玉米等作物，是我國乃至全球谷物最重要的污染真菌之一[22]。黃曲霉菌體由許多復(fù)雜的菌絲構(gòu)成，主要為營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲。菌絲形成分生孢子梗從而產(chǎn)生孢子，可隨空氣傳播侵染宿主。菌絲在一定的環(huán)境下可產(chǎn)生黃曲霉毒素[23]，黃曲霉毒素中AFB1對人的肝臟組織破壞作用最嚴(yán)重，可能導(dǎo)致肝癌甚至死亡[24]。

本實驗從黃曲霉孢子、菌絲及產(chǎn)AFB1等方面探索AMP-17對黃曲霉的抗菌功效。研究發(fā)現(xiàn)AMP-17對黃曲霉菌的MIC值僅為50 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的防腐劑山梨酸鉀的抑菌濃度。結(jié)合黃曲霉生長曲線來看，證明AMP-17能顯著抑制黃曲霉的生長。研究結(jié)果與小麥PINA蛋白抑制黃曲霉生長是一致的[25]。蔣立科等[26]研究證實0.5 mg/L檸檬醛能使孢子抑制率達(dá)61.4%，本研究也發(fā)現(xiàn)黃曲霉萌發(fā)率隨AMP-17濃度升高而降低，當(dāng)AMP-17質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，其萌發(fā)率僅為8%，孢子萌發(fā)受阻從而抑制了黃曲霉形態(tài)的轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步阻止黃曲霉形成新的孢子。最重要的是AMP-17通過抑制黃曲霉生長從而較少合成AFB1，這與枯草芽孢桿菌及其桿菌霉素D能有效抑制黃曲霉毒素的合成結(jié)果吻合[27]。

掃描電鏡結(jié)果顯示AMP-17可阻止黃曲霉分生孢子梗的形成，破壞孢子和菌絲結(jié)構(gòu)完整性，提示其可能是通過損傷黃曲霉孢子及菌絲體細(xì)胞膜，使菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、胞質(zhì)外流，導(dǎo)致菌細(xì)胞破裂死亡，從而有效抑制黃曲霉生長發(fā)育。在前期研究中我們已證實AMP-17對真菌細(xì)胞膜麥角甾醇的合成有影響[28]，趙欣宇等[12]發(fā)現(xiàn)AMP-17能顯著抑制白色念珠菌菌絲的形成并且能破壞已形成的菌絲結(jié)構(gòu)。故我們推測AMP-17也可能通過影響黃曲霉孢子及菌絲細(xì)胞膜上的麥角甾醇的合成而導(dǎo)致細(xì)胞膜功能異常，但具體的抗菌機制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文研究了AMP-17對黃曲霉的生長發(fā)育和產(chǎn)毒的影響，發(fā)現(xiàn)其能抑制黃曲霉孢子萌發(fā)、破壞孢子及菌絲結(jié)構(gòu)、降低黃曲霉AFB1的含量。提示AMP-17具有強效的防霉防腐效果，可應(yīng)用于糧食作物的保鮮貯藏，延長保質(zhì)期，為開發(fā)新天然防腐劑提供了一定的實驗支持。