安 婧，張 琪，于 楠，周鵬程，曾名湧，董士遠(yuǎn)

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是糖類與蛋白質(zhì)、氨基酸等經(jīng)美拉德反應(yīng)形成的一類復(fù)雜化合物總稱。AGEs種類眾多，廣泛存在于生物體與食品中。研究發(fā)現(xiàn)，膳食中AGEs是體內(nèi)AGEs積累的重要來源，其AGEs在體內(nèi)積累與糖尿病、阿爾茲海默癥、帕金森綜合征等慢性疾病密切相關(guān)。目前，已對(duì)食品中代表性AGEs——羧甲基賴氨酸（N-carboxymethyllysine，CML）開展廣泛研究，而對(duì)羧乙基賴氨酸（N-carboxyethyllysine，CEL）、甲基乙二醛氫咪唑酮（N-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine，MG-H1）等其他AGEs的研究已成為近年來研究熱點(diǎn)。

食品中AGEs形成與其組成成分、加工工藝等密切相關(guān)。Assar等發(fā)現(xiàn)牛肉中CML含量隨熱處理程度的增加而增加；Tavares等發(fā)現(xiàn)干熱加工對(duì)AGEs形成的促進(jìn)作用高于濕熱加工。Goldberg等發(fā)現(xiàn)脂肪和蛋白含量高的食物中AGEs含量較高，而由碳水化合物組成的食物（淀粉、蔬菜、水果）AGEs含量較低。魚加工食品在烘烤、煎炸等高溫加工中易促進(jìn)AGEs的形成。然而，目前國(guó)內(nèi)尚缺乏針對(duì)市售魚加工食品中AGEs含量方面的研究。分析市售魚加工食品中AGEs水平，有利于提升其安全水平。因此，本研究嘗試建立魚加工食品中3 種AGEs含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）檢測(cè)方法，使用該方法分析65 種市售魚加工食品的AGEs含量及組成成分，揭示其AGEs含量與組成成分的關(guān)系，為探究魚加工食品AGEs含量檢測(cè)與限量標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用魚加工食品均購(gòu)于青島臺(tái)東沃爾瑪購(gòu)物中心。

CML、CEL、CML-、CEL-標(biāo)準(zhǔn)品 加拿大Toronto Research Chemicals公司；MG-H1標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)International Laboratory公司；MG-H1-標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Bioberry公司；其他試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC儀、Xevo TQ-S MS儀、ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Atlantis HILIC Silica（2.1 mm×100 mm，3 μm）、Symmetry C（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）美國(guó)Waters公司；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；BCD-190TMPK冰箱青島海爾股份有限公司；DHG-9036A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LC-CQ-24F固相萃取裝置 上海力辰邦西儀器科技有限公司；N-20多功能氮吹儀 山東云網(wǎng)科技有限公司；8400全自動(dòng)凱氏定氮儀瑞典福斯公司；SXT-06索氏提取器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；Synergy H4酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品分組

選取市場(chǎng)上代表性烘烤類、油炸類、罐頭類和干制類等65 種魚加工食品，置于－20 ℃保存。

1.3.2 AGEs含量測(cè)定

1.3.2.1 樣品前處理

將約300 g魚加工食品粉碎并混合均勻，稱取20 mg待分析樣品加入0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液和2 mol/L硼氫化鈉溶液，4 ℃條件下還原8 h；加入6 mol/L HCl溶液后110 ℃水解24 h；烘干復(fù)溶后加入CML-、CEL-、MG-H1-標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過濾膜后進(jìn)行固相萃?。ㄓ眉状己腕w積分?jǐn)?shù)2%甲酸溶液依次活化MCX柱，待測(cè)液過柱后用2%甲酸溶液和甲醇依次除雜，用5%氨水-甲醇洗脫目標(biāo)化合物）；氮吹至近干，復(fù)溶，過濾膜，待測(cè)。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別稱取CML、CEL、MG-H1、CML-、CEL-、MG-H1-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5 mg（精確至0.001 mg），用超純水配制5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于－20 ℃冰箱保存。配制3 種AGEs內(nèi)標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度均為50 ng/mL，繪制0～200 ng/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量3.0 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：0.25 mol/L乙酸銨和體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液為A相，乙腈為B相；梯度洗脫程序：0～1.0 min，15% A、85% B；1.0～6.5 min，15%～35% A、85%～65% B；6.5～9.0 min，35% A、65% B；9.0～10.0 min，35%～15% A、65%～85% B。

1.3.2.4 MS條件

離子源：電噴霧離子源正離子模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓30 V；脫溶劑氣溫度450 ℃；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流速850 L/h；錐孔反吹氣流速150 L/h；碰撞氣流速0.12 mL/min；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；CML、CEL、MG-H1的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 AGEs多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring mass spectrometric parameters for analysis of AGEs

1.3.3 蛋白、脂肪、總糖、水分含量測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定：按照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法；脂肪測(cè)定：按照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》中索氏提取法；總糖測(cè)定：按照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》中苯酚硫酸法；水分含量測(cè)定：按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法。

1.3.4 乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）含量測(cè)定

1.3.4.1 樣品前處理

取0.2 g樣品加入5 mL體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液（磷酸鹽緩沖液配制），振蕩1 h后離心15 min，取上清液加入10 mg/mL鄰苯二胺溶液，60 ℃暗條件下衍生1 h，用甲醇和超純水依次活化Poly-Sery HLB-Pro固相萃取柱，待測(cè)液過柱后用超純水除雜，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液洗脫，過0.22 μm聚醚砜濾膜待測(cè)。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制0、0.05、0.10、0.15、0.20 μg/mL GO、MGO標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mg/mL鄰苯二胺溶液，60 ℃暗條件下衍生1 h，用甲醇和超純水依次活化Poly-Sery HLB-Pro固相萃取柱，待測(cè)液過柱后用超純水除雜，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液洗脫，過0.22 μm PES濾膜待測(cè)。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱：Symmetry C色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸溶液（A 相）和甲醇（B相），梯度洗脫程序：0～2.5 min，70%～40% A、30%～6 0% B；2.5～5.0 min，4 0%～3 0% A、60%～7 0% B；5.0～7.0 min，30%～70% A、70%～30% B；7.0～10.0 min，70% A、30% B。

1.3.4.4 MS條件

質(zhì)譜條件見1.3.2.4節(jié)。GO、MGO的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 二羰基化合物多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集參數(shù)Table 2 MRM mass spectrometric acquisition parameters for determination of α-dicarbonyl compounds

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用GraphPad Prism 8.2.1軟件作圖，采用Rv3.5.0及RStudio v1.1.453軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGEs檢測(cè)方法建立

UPLC-MS/MS因其具有靈敏度高和定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)被用于AGEs的檢測(cè)。Hull等使用UPLC-MS/MS建立食品中CML含量的檢測(cè)方法；Scheijen等使用UPLC-MS/MS建立同時(shí)檢測(cè)CML、CEL以及MG-H1含量的方法。然而，現(xiàn)有方法存在離子對(duì)試劑使用、耗時(shí)長(zhǎng)等問題。本研究比較3 種色譜柱對(duì)AGEs的分離效果，發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對(duì)CML、CEL、MG-H1具有良好的保留及分離效果，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)乙腈-水溶液（水相中含0.25 mol/L乙酸銨和1%甲酸）對(duì)3 種AGEs分離效果最佳，該條件下CML、CEL、MG-H1保留時(shí)間分別為8.30、7.96、6.53 min（圖1）。在10～200 ng/mL范圍內(nèi)，CML、CEL、MG-H1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（=0.999），檢出限低至2 ng/mL，定量限小于10 ng/mL（表3），精密度為1.35%～3.10%，加標(biāo)回收率為80.13%～122.90%（表4）。因此，優(yōu)化后建立的分析方法符合AGEs分析要求。

圖1 CML、CEL和MG-H1的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of Nε-carboxymethyllysine,Nε-carboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

表3 CML、CEL和MG-H1的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Calibration curves,limits of detection and limits of quantification of Nε-carboxymethyllysine,Nε-carboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

表4 CML、CEL和MG-H1的精密度和回收率Table 4 Precision and recoveries for Nε-carboxymethyllysine,Nεcarboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

2.2 市售魚加工食品中AGEs含量

應(yīng)用所建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法分析65 種市售魚加工食品的AGEs含量（以每100 g蛋白計(jì)），結(jié)果見圖2。魚加工食品的MG-H1含量為10.01～145.11 mg/100 g，CEL 含量為2.41～84.83 mg/100 g，CML 含量為1.93～35.31 mg/100 g。所有魚加工食品中MG-H1含量均高于CML和CEL含量，其中茄汁沙丁魚罐頭的MG-H1含量約為其CML含量的20 倍，烤獅子魚片的MG-H1含量為其CEL含量的11 倍。Scheijen等分析荷蘭當(dāng)?shù)厝庵破贰⑷橹破?、魚制品、水果、蔬菜等190 種食品中的AGEs含量時(shí)也發(fā)現(xiàn)MG-H1含量大于CML和CEL含量的趨勢(shì)。另外，罐頭類魚加工食品中3 種AGEs含量均呈較高水平，CML、CEL、MG-H1平均含量分別為13.20、34.26、62.73 mg/100 g，且含量分布范圍較大，推測(cè)罐頭制品的較高AGEs含量與其采用相對(duì)劇烈的殺菌方式有關(guān)。干制類魚加工食品中AGEs含量普遍較低，其CML、CEL、MG-H1平均含量分別為6.45、6.07、19.48 mg/100 g。

圖2 魚加工食品的CML（A）、CEL（B）和MO-H1（C）含量分布箱形圖Fig.2 Box plots of contents of Nε-carboxymethyllysine (A),Nεcarboxyethyllysine (B) and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine (C) in fish products

2.3 市售魚加工食品組分及二羰基化合物含量

魚加工食品的蛋白、脂肪、總糖、水分等組分含量受原料、輔料添加及加工過程的影響。65 種市售魚加工食品的蛋白、脂肪、總糖、水分含量，如圖3所示。4 類魚加工食品的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.68%～83.10%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.68%～50.59%、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.37%～43.13%（均以干質(zhì)量計(jì)），水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.30%～82.70%（以濕質(zhì)量計(jì)）。油炸類魚加工食品蛋白含量相對(duì)較少與油炸會(huì)增加魚加工食品的脂肪含量相關(guān)，烘烤類及油炸類魚加工食品在加工過程中通常需要添加糖類以促進(jìn)魚加工食品的顏色及風(fēng)味物質(zhì)形成，因此其具有較高的總糖含量。與其他3 類魚加工食品相比，罐頭類魚加工食品加工方式及輔料添加較為復(fù)雜，導(dǎo)致其脂肪、水分含量范圍較大（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.54%～50.59%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.30%～82.70%）。

圖3 魚加工食品的蛋白（A）、脂肪（B）、總糖（C）和水分（D）含量分布箱形圖Fig.3 Box plots of contents of proteins (A),lipids (B),total sugars (C) and moisture (D) in fish products

GO、MGO等二羰基化合物是形成AGEs重要前體物質(zhì)。65 種魚加工食品的GO、MGO含量（以每千克蛋白計(jì)）如圖4所示。GO含量為0.02～22.56 mg/kg，紅杉魚干、紅娘魚干、油炸鰻魚絲、香辣銀魚、蒲燒秋刀魚具有較高GO含量（大于10 mg/kg）；MGO含量為0.02～12.19 mg/kg，茄汁沙丁魚與紅燒金槍魚具有較高M(jìn)GO含量（大于10 mg/kg）。4 類魚加工食品中，油炸類魚加工食品GO平均含量最高（7.43 mg/kg），油炸類、罐頭類魚加工食品MGO平均含量較高，烘烤類魚加工食品GO、MGO平均含量均最低。魚加工食品在加工過程中，其自身成分通過糖降解等途徑產(chǎn)生GO、MGO，同時(shí)調(diào)味品的添加也會(huì)引入GO、MGO。此外，罐頭類魚加工食品的GO、MGO含量還與殺菌工藝有關(guān)，Zhu Zongshuai等發(fā)現(xiàn)雞肉經(jīng)殺菌處理后GO含量增加，MGO含量降低。油炸類魚加工食品中GO含量與烘烤類、罐頭類魚加工食品中GO含量存在顯著差異（＜0.05）。

圖4 魚加工食品的GO（A）和MGO（B）含量分布箱形圖Fig.4 Box plots of contents of glyoxal (A) and methylglyoxal (B) in fish products

2.4 PCA及相關(guān)性分析

如圖5A所示，PCA發(fā)現(xiàn)，罐頭類魚加工食品中AGEs呈較高水平。Scheijen等應(yīng)用UPLC-MS/MS分析190 種食品中CML、CEL、MG-H1水平發(fā)現(xiàn)罐頭食品含有較高的AGEs。如圖5B所示，魚加工食品中3 種AGEs含量與脂肪含量呈顯著正相關(guān)，這可能與魚加工食品中脂肪氧化產(chǎn)生豐富的AGEs前體物質(zhì)-二羰基化合物有關(guān)。CML與CEL（=0.69，＜0.001）、MG-H1含量（=0.54，＜0.001）呈顯著正相關(guān)，CEL與MG-H1含量呈顯著正相關(guān)（=0.81，＜0.001）；Michael、Sun Xiaohua等認(rèn)為，3 種AGEs形成可能存在相同途徑。CML、CEL、MG-H1含量與蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，CML、CEL與總糖含量不相關(guān)，CML、CEL、MG-H1含量與GO、MGO等二羰基化合物含量不相關(guān)。劉慧琳等發(fā)現(xiàn)，牛血清蛋白-葡萄糖模擬體系中CML含量與蛋白、葡萄糖濃度之間均呈正相關(guān)，這可能是由于模擬體系的糖含量遠(yuǎn)高于食品體系，因此模擬體系中AGEs生成量隨蛋白含量的增加而增加，食品體系糖含量的不確定性導(dǎo)致其中AGEs含量與蛋白含量之間呈明顯的相關(guān)性，這需要進(jìn)一步深入研究。

圖5 魚加工食品中所有指標(biāo)的PCA（A）及相關(guān)性分析（B）Fig.5 PCA plot (A) and correlation heat map (B) of all tested indicators in fish products evaluated together

為比較各指標(biāo)在不同種類魚加工食品中的相關(guān)性，分別對(duì)烘烤類、油炸類、罐頭類、干制類等4 類魚加工食品的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行PCA（圖6）發(fā)現(xiàn)，烘烤類魚加工食品中CML-含量與脂肪含量呈正相關(guān)，MG-H1含量與MGO含量呈正相關(guān)。干制類魚加工食品中MG-H1含量與MGO含量同樣呈正相關(guān)，這是由于MGO為MG-H1前體物質(zhì)。油炸類魚加工食品中GO含量與總糖含量呈正相關(guān)，CML、CEL含量與蛋白含量呈正相關(guān)。干制類魚加工食品中CML、CEL含量與蛋白含量也呈正相關(guān)，這可能是由于蛋白含量越高，可被糖基化修飾的賴氨酸等殘基也相應(yīng)增多，導(dǎo)致其產(chǎn)生較高的AGEs含量。罐頭類、干制類魚加工食品中CML、CEL含量與水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，水分通過減少油脂與蛋白的接觸影響美拉德反應(yīng)進(jìn)程，導(dǎo)致AGEs含量隨水分含量的降低而上升。

圖6 魚加工食品中所有指標(biāo)的PCAFig.6 PCA plots of all tested indicators in fish processing foods evaluated separately

3 結(jié)論

建立檢測(cè)魚加工食品中CML、CEL和MG-H1三種AGEs的UPLC-MS/MS方法；使用該方法分析65 種市售魚加工食品的AGEs含量，發(fā)現(xiàn)魚加工食品中MG-H1含量遠(yuǎn)高于CEL和CML；罐頭類魚加工食品中AGEs含量呈較高水平，而干制品中3 種AGEs的含量相對(duì)較低。魚加工食品中3 種AGEs含量之間呈顯著正相關(guān)；其AGEs含量與脂肪含量呈顯著正相關(guān)，與蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)；烘烤類、干制類魚加工食品中MG-H1含量與MGO含量呈正相關(guān)。本研究為探究魚加工食品AGEs含量檢測(cè)與限量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論基礎(chǔ)，對(duì)提升魚加工食品安全水平具有重要意義。