王新天，陳洪建，李曉雯，彭登峰，陳亞淑，鄧乾春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062）

亞麻籽油是我國(guó)主要食用油脂之一，是-亞麻酸的良好來(lái)源（約60%）。-亞麻酸作為一種以植物資源為主的-3多不飽和脂肪酸，能夠作為前體在體內(nèi)合成具有更高營(yíng)養(yǎng)功效的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，具有綠色安全、原料易得、受眾廣泛等突出優(yōu)勢(shì)。亞麻籽油不僅含有甘油三酯，還含有游離脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯、磷脂、植物甾醇等具有表面活性的微量成分。這種兩親性微量成分可以吸附到油水界面，當(dāng)濃度高于其臨界膠束濃度時(shí)，由于疏水作用而自發(fā)聚集，在油脂中形成反膠束。這些微量成分形成的反膠束可以在油脂中產(chǎn)生油水界面，影響脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的極性物質(zhì)以及水溶性金屬離子的物理分配，進(jìn)而影響油脂的物理及氧化穩(wěn)定性。因此，亞麻籽油中內(nèi)源性微量成分形成的反膠束對(duì)食用油的穩(wěn)定性及貨架期有重要影響。

生育酚作為一種天然的脂溶性維生素，是植物油中最主要的天然抗氧化劑。但在貯藏過(guò)程中生育酚氧化生成具有表面活性的氧化生育酚，它們可以降低油的界面張力，導(dǎo)致氧氣轉(zhuǎn)移到油中，從而促進(jìn)脂質(zhì)氧化。反膠束可改變化學(xué)反應(yīng)的微環(huán)境，作為有效的納米反應(yīng)器，影響抗氧化劑的抗氧化效應(yīng)，改變植物油體系的穩(wěn)定性。反膠束可以將抗氧化劑、極性氧化產(chǎn)物向油水界面遷移，并影響抗氧化劑的分解以及對(duì)金屬離子的還原能力，從而增強(qiáng)/降低抗氧化劑有效性。亞麻籽油中微量成分形成的反膠束以及和生育酚的組合對(duì)亞麻籽油熱穩(wěn)定性及氧化穩(wěn)定性的影響還知之甚少。在存在反膠束的天然油脂體系中，對(duì)反膠束與抗氧化劑的調(diào)控將直接影響油脂穩(wěn)定性，這為富含-3多不飽和脂肪酸油脂的穩(wěn)態(tài)化控制提供了新的策略與途徑。

為探究亞麻籽油中微量成分形成的反膠束對(duì)亞麻籽油體系穩(wěn)定性的影響，通過(guò)測(cè)量油酸、二?；视停╠iacyl glycerol，DAG）、1,2-二油酰基卵磷脂（1,2-dioleoyl--glycero-3-phosphocholine，DOPC）和-谷甾醇在stripped亞麻籽油（stripped flaxseed oil，SFO）中的臨界膠束濃度，研究其形成反膠束的能力。并進(jìn)一步研究形成的反膠束對(duì)亞麻籽油熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性以及對(duì)生育酚抗氧化效應(yīng)的影響，為天然油脂體系中微量成分形成的反膠束對(duì)油脂穩(wěn)定性以及對(duì)抗氧化劑抗氧化效應(yīng)的影響提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DOPC（CAS 4235-95-4，99%） 美國(guó)Avanti公司；-谷甾醇（CAS∶ 83-46-5，95%） 上海萌芽生物公司；甘油三酯（medium-chain triacylglycerols，MCT，CAS：538-24-9，96%） 印尼Miglyol公司；油酸（CAS 112-80-1，99%）、DAG（CAS 24529-88-2，97%）、-生育酚（CAS 10191-41-0，97%）、7,7,8,8-四氰基對(duì)苯二醌二甲烷（7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane，TCNQ，CAS 1518-16-7，98%）、丙醛（CAS 123-38-6，97%）、正己醛（CAS 66-25-1，98%） 美國(guó)Sigma公司；正己烷等有機(jī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6980氣相色譜儀 安捷倫（中國(guó)）有限公司；LC-6AD液相色譜儀 日本島津公司；DU 800紫外分光光度儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；IKARV10D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國(guó)艾卡公司；DSC Q2000差示掃描量熱儀美國(guó)TA公司；743氧化誘導(dǎo)儀 瑞士萬(wàn)通公司。

1.3 方法

1.3.1 SFO的制備

根據(jù)Kiralan等的方法使用柱色譜法制備SFO。將100 g硅膠用總體積為3 L的蒸餾水洗滌3 次，并在125 ℃條件下活化12 h。然后依次用90 g硅膠、22.52 g活性炭和另外90 g硅膠填充色譜柱（內(nèi)徑5.0 cm，高50 cm）。將120 g油溶解在120 mL正己烷中通過(guò)該柱，用1 L正己烷洗脫。為了延緩過(guò)程中油脂氧化，收集的SFO保存在冰浴中并用鋁箔覆蓋。完成洗脫后，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在37 ℃除去正己烷，在氮?dú)饬飨鲁ノ⒘繗埩羧軇玫絊FO，并在－80 ℃貯藏，進(jìn)行進(jìn)一步分析。采用氣相色譜儀和液相色譜儀測(cè)定SFO中微量成分的含量。

1.3.2 亞麻籽油基本成分測(cè)定

酸價(jià)、過(guò)氧化值、脂肪酸含量分別參照GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》、GB 5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》、GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》的方法測(cè)定；生育酚含量按照AOCS Official Method Ce 8-89測(cè)定；植物甾醇含量按照黃穎等的方法測(cè)定。

1.3.3 臨界膠束濃度測(cè)定

采用TCNQ增溶技術(shù)測(cè)定亞麻籽油中多種微量成分的臨界膠束濃度。將MCT和SFO（3∶1，/，MCT作為一種不可氧化脂質(zhì)）混合作為植物油體系。以下所述亞麻籽油均指MCT與SFO的混合油。將DOPC、-谷甾醇、油酸、D A G 及其混合物（物質(zhì)的量比3.78∶0.97∶0.43∶2.25）添加到亞麻籽油中，測(cè)定范圍為1～1 000 μmol/kg的臨界膠束濃度。該比例旨在模仿商業(yè)精煉油中主要表面活性化合物的比例。將含有表面活性成分的油在室溫下磁力攪拌24 h，然后按1 mg/g加入TCNQ，混合攪拌5 h。以2 000×離心20 min除去過(guò)量的TCNQ。使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)480 nm處測(cè)量吸光度。吸光度與表面活性成分濃度對(duì)數(shù)圖的拐點(diǎn)即為臨界膠束濃度。

1.3.4 貯藏樣品制備

以低于（10 μmol/kg）和高于（500 μmol/kg）的臨界膠束濃度，將微量成分（DOPC、-谷甾醇、油酸和DAG）的混合物添加到亞麻籽油中。為了研究抗氧化劑活性，在上述樣品中分別添加10 μmol/kg-生育酚。所有樣品在室溫下磁力攪拌24 h，將樣品（1 mL）等分到10 mL頂空樣品瓶中，蓋上PTFE/硅氧烷隔墊的鋁蓋，并在55 ℃避光貯藏。

1.3.5 氧化起始溫度測(cè)定

采用差示掃描量熱儀測(cè)定油的熱特性。根據(jù)Oomah等的方法，并稍作修改。氮?dú)饬魉贋?00 mL/min，稱取8 mg油樣品放置于鋁盒中，空鋁盒作為參考。將樣品盒與參考鋁盒置于熱量計(jì)內(nèi)部，從室溫降低到10 ℃并維持10 min，然后在氧氣存在下（100 mL/min），以2 ℃/min加熱至350 ℃。測(cè)定重復(fù)3 次。

1.3.6 氧化誘導(dǎo)時(shí)間測(cè)定

參考AOCS Method CD12b-92方法，并適當(dāng)修改。采用氧化誘導(dǎo)儀測(cè)定亞麻籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間。取3.00 g油樣放置在玻璃反應(yīng)試管中，在110 ℃條件下，向油脂中以恒定速率（20 L/min）通入干燥空氣。測(cè)定油脂在達(dá)到恒定溫度后的氧化誘導(dǎo)時(shí)間?？寡趸禂?shù)按下式計(jì)算：

式中：PF為抗氧化系數(shù)；IP’和IP分別為添加和不添加抗氧化劑的油脂的氧化誘導(dǎo)時(shí)間/h。

1.3.7 脂質(zhì)氫過(guò)氧化物測(cè)定

采用紫外分光光度計(jì)法對(duì)亞麻籽油中氫過(guò)氧化物含量進(jìn)行測(cè)定。取油樣（200 μL）與2.8 mL甲醇-丁醇溶液（2∶1，/）混合，再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨和15 μL Fe。Fe是由0.132 mol/L BaCl（0.4 mol/L HCl配制）與0.144 mol/L FeSO等體積混合，取上清液得到。將混合物渦旋，室溫孵育20 min，在波長(zhǎng)510 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。以異丙苯氫過(guò)氧化物為標(biāo)準(zhǔn)物制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定氫過(guò)氧化物含量，單位為mmol/kg。

1.3.8 次級(jí)氧化產(chǎn)物丙醛、己醛測(cè)定

采用氣相色譜結(jié)合固相微萃取技術(shù)分析植物油體系中丙醛、己醛含量。取1 mL乳液于10 mL頂空瓶中，壓蓋密封。將固相微萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）通過(guò)壓蓋膜插入并暴露于頂空瓶上部。55 ℃磁力攪拌，纖維頭充分吸取揮發(fā)性物質(zhì)10 min，將纖維頭轉(zhuǎn)移至氣相色譜進(jìn)樣口解吸5 min后進(jìn)行測(cè)樣。進(jìn)樣口溫度240 ℃，分流比1∶5；揮發(fā)性物質(zhì)使用DB-5色譜柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm）進(jìn)行分離，柱溫箱、進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度分別為40、240 ℃和300 ℃，柱溫箱升溫程序：40 ℃保持6 min，以5 ℃/min升高至60 ℃，最后以30 ℃/min升高至280 ℃并以該溫度保持2 min。分別使用丙醛、正己醛為外標(biāo)對(duì)乳液中的丙醛、己醛含量進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SFO中微量組分含量

為更準(zhǔn)確研究微量成分及其形成的反膠束對(duì)油脂穩(wěn)定性以及抗氧化劑活性的影響，首先將市售亞麻籽油經(jīng)硅膠-活性炭-硅膠色譜柱制得SFO，除去本身含有的微量成分以及抗氧化劑。由表1可以看出，亞麻籽油中主要植物甾醇為-谷甾醇（（142.35±0.49）mg/100 g），富含-亞麻酸（54.59%）及油酸（20.64%）。與市售亞麻籽油相比，使用色譜柱法制備的SFO呈無(wú)色透明狀，主要脂肪酸組成沒(méi)有變化，-谷甾醇、菜油甾醇和環(huán)阿屯醇含量顯著降低，而豆甾醇、燕麥甾醇、極性酚類化合物（磷脂和生育酚）等被完全脫除。

表1 經(jīng)硅膠-活性炭-硅膠色譜柱后亞麻籽油中成分含量變化Table 1 Changes in the composition of flaxseed oil after adsorption on silica gel-activated carbon-silica gel column

2.2 微量組分在亞麻籽油中的臨界膠束濃度

植物油體系中存在微量水時(shí)，當(dāng)表面活性成分達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)發(fā)生自聚集形成由單層表面活性劑分子穩(wěn)定的納米級(jí)水核，表面活性劑的極性基團(tuán)延伸到水核中，脂肪鏈延伸到脂質(zhì)介質(zhì)中。表面活性分子開(kāi)始聚集的濃度即為臨界膠束濃度。本研究采用TCNQ增溶技術(shù)測(cè)定了各種微量成分在亞麻籽油中的臨界膠束濃度。由圖1可以看出，DOPC的臨界膠束濃度為125 μmol/kg，其值比Kittipongpittaya等在55 ℃測(cè)定的數(shù)值（40 μmol/kg）大，可能是因?yàn)楸狙芯吭谑覝叵聹y(cè)得，磷脂的臨界膠束濃度隨著溫度的升高而降低。而油酸、-谷甾醇、DAG沒(méi)有觀察到典型的臨界膠束濃度拐點(diǎn)，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致。盡管油酸，DAG和-谷甾醇能夠集中在油水界面，但它們?cè)诒狙芯渴褂玫臐舛认虏粫?huì)形成反膠束。DOPC是亞麻籽油體系形成反膠束的重要組分。將DOPC、油酸、-谷甾醇、DAG四種微量成分按物質(zhì)的量比混合（3.78∶0.97∶0.43∶2.25），測(cè)得臨界膠束濃度為129 μmol/kg，與單一DOPC的臨界膠束濃度相差不大。

圖1 室溫下DOPC、油酸、β-谷甾醇、DAG在油脂體系（MCT∶SFO=3∶1）中的臨界膠束濃度Fig.1 Critical micelle concentrations of DOPC,oleic acid,β-sitosterol,and DAG in oil system (MCT:SFO=3:1) at room temperature

2.3 氧化起始溫度與氧化誘導(dǎo)時(shí)間

將上述幾種微量成分混合物以低于/高于臨界膠束濃度加入到亞麻籽油中，測(cè)定其對(duì)亞麻籽油體系穩(wěn)定性的影響及對(duì)生育酚抗氧化活性的影響。差式掃描量熱法可在系統(tǒng)控制溫度下，測(cè)量物質(zhì)與參比物之間的能量差隨溫度的變化關(guān)系。通過(guò)DSC可以確定油脂的氧化起始溫度，氧化起始溫度越高，油脂的穩(wěn)定性越好。油脂的氧化誘導(dǎo)時(shí)間是油脂到達(dá)氧化加速期之前的時(shí)期，常用誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短衡量植物油脂的抗氧化能力?？寡趸禂?shù)值越高說(shuō)明抗氧化效應(yīng)越好。由表2可知，與對(duì)照組相比，加入少量微量成分以及生育酚對(duì)其氧化起始溫度（約132 ℃）以及氧化誘導(dǎo)時(shí)間（約0.41 h）沒(méi)有顯著影響，抗氧化系數(shù)達(dá)到0.9～1.0，說(shuō)明無(wú)抗氧化性也無(wú)促氧化性。但當(dāng)加入量超過(guò)臨界膠束濃度，反膠束的形成使油脂的氧化起始溫度從132.86 ℃降低到116.81 ℃，降低了12%。此時(shí)生育酚的加入并不能提高油脂的起始氧化溫度（116.81 ℃）。且反膠束使油脂氧化誘導(dǎo)時(shí)間從0.42 h降低到0.28 h，降低了33%，抗氧化系數(shù)為0.67，說(shuō)明具有促氧化效應(yīng)。反膠束的形成使含有生育酚的亞麻籽油體系的抗氧化系數(shù)從0.98降低為0.73，表現(xiàn)出促氧化效應(yīng)，降低了生育酚的抗氧化活性。

表2 不同油脂的氧化起始溫度與氧化誘導(dǎo)時(shí)間Table 2 Oxidation initiation temperature and oxidation induction time of different flaxseed oil samples

由氧化起始溫度及氧化誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)現(xiàn)微量成分的少量加入對(duì)油脂穩(wěn)定性以及生育酚的抗氧化活性無(wú)顯著影響。添加量超過(guò)臨界膠束濃度而形成反膠束后，其能明顯降低油脂熱穩(wěn)定性，并降低生育酚的抗氧化效應(yīng)。

2.4 脂質(zhì)氫過(guò)氧化物

脂質(zhì)氧化是導(dǎo)致不良風(fēng)味和香氣，降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及食用油中潛在安全問(wèn)題的主要因素。純油體系中具有兩親性的微量成分在物理和化學(xué)上都會(huì)影響脂質(zhì)的氧化機(jī)制。由圖2可以看出，貯藏過(guò)程中，反膠束的形成促使亞麻籽油從透明狀逐漸變?yōu)榈S色，形成了共軛化合物，顯示出促氧化活性。其余樣品在整個(gè)貯藏期間呈無(wú)色透明狀。

圖2 油脂貯藏過(guò)程中外觀變化Fig.2 Visual appearance of flaxseed oil during storage

如圖3所示，與對(duì)照組相比，10 μmol/kg混合組分（低于臨界膠束濃度）的加入沒(méi)有改變脂質(zhì)氫過(guò)氧化物形成的滯后期，其含量稍微增加。生育酚的加入能抑制油脂的氧化程度，但添加10 μmol/kg微量成分使生育酚的抑制作用減弱。當(dāng)微量成分達(dá)到500 μmol/kg（超過(guò)臨界膠束濃度）時(shí)，氫過(guò)氧化物濃度在初始階段急速增加，幾乎沒(méi)有滯后期。與對(duì)照組相比，初級(jí)氧化產(chǎn)物生成量增加36%，說(shuō)明反膠束表現(xiàn)出促氧化的作用。這與之前的研究一致，即由表面活性成分形成的反膠束降低了油脂的氧化穩(wěn)定性。生育酚的添加能抑制油脂氧化，但反膠束的形成使其氧化產(chǎn)物濃度高于對(duì)照組，說(shuō)明反膠束降低了生育酚的抗氧化活性（約33.6%）。這可能是因?yàn)榉茨z束的存在可以降低表面張力，增加氧氣向油中的轉(zhuǎn)移。且在游離脂肪存在的情況下，DOPC反膠束可能通過(guò)增加體系中游離脂肪酸的促氧化活性而對(duì)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，DOPC形成的反膠束還可以吸引金屬離子和脂質(zhì)過(guò)氧化氫到油水界面處加速脂質(zhì)氧化速率，從而降低油脂的氧化穩(wěn)定性。而反膠束限制了-生育酚對(duì)界面的可及性，很難聚集在油水界面，因此其抗氧化活性降低。

圖3 油脂貯藏過(guò)程中脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的形成Fig.3 Lipid hydroperoxide formation in flaxseed oil during storage

2.5 次級(jí)氧化產(chǎn)物丙醛、己醛含量測(cè)定

如圖4A所示，與對(duì)照組相比，10 μmol/kg混合組分（低于臨界膠束濃度）的加入抑制了丙醛的生成，這可能是因?yàn)榧尤氲腄OPC具有一定的抗氧化作用，抑制初級(jí)產(chǎn)物向次級(jí)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，且生育酚的加入使抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。然而當(dāng)添加量達(dá)到臨界膠束濃度以上形成反膠束時(shí)，其形成丙醛的速率急速增加（含量增加約13%）。在含有生育酚的亞麻籽油中，反膠束的形成使氧化產(chǎn)物濃度顯著增加，與反膠束體系接近，此時(shí)生育酚并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抗氧化效果。因初級(jí)氧化產(chǎn)物氫過(guò)氧化物具有兩親性，聚集在油水界面，被過(guò)渡金屬離子催化發(fā)生裂解反應(yīng)，導(dǎo)致丙醛等次級(jí)氧化產(chǎn)物的生成。

圖4 油脂貯藏過(guò)程中次級(jí)氧化產(chǎn)物丙醛（A）、己醛（B）的形成Fig.4 Propionaldehyde (A) and hexanal (B) formation in flaxseed oil during storage

如圖4B所示，與丙醛的生成趨勢(shì)相似，與對(duì)照組相比，生育酚的加入顯著抑制己醛生成，并且低濃度混合組分（10 μmol/kg，低于臨界膠束濃度）的加入對(duì)生育酚的抑制效應(yīng)沒(méi)有影響。當(dāng)濃度達(dá)到臨界膠束濃度以上形成反膠束時(shí)，己醛含量比對(duì)照組顯著增加。在含有生育酚的亞麻籽油中，反膠束的形成亦會(huì)顯著增加己醛的生成，表現(xiàn)出促氧化性。

反膠束的促氧化性可能與脂質(zhì)氧化鏈傳播過(guò)程存在傳質(zhì)現(xiàn)象有關(guān)，即一個(gè)顆粒的氧化產(chǎn)物傳遞到另一個(gè)顆粒中導(dǎo)致氧化的傳播。一般水溶性物質(zhì)通過(guò)水?dāng)U散傳播，脂溶性物質(zhì)只能通過(guò)顆粒碰撞-交換-分離來(lái)進(jìn)行氧化傳播，而在膠束存在的情況下，脂溶性物質(zhì)可以通過(guò)膠束輔助轉(zhuǎn)移從一個(gè)粒子擴(kuò)散到另一個(gè)粒子，這個(gè)途徑會(huì)比顆粒碰撞-交換-分離途徑轉(zhuǎn)移速率快很多，大大增加了脂溶性物質(zhì)的傳播速率。因此，除了氧化速率增加外，反膠束的存在可能改變了氧化產(chǎn)物的傳遞途徑導(dǎo)致氧化速率大大增加。此外一些氧化產(chǎn)物的累積，例如脂質(zhì)氫過(guò)氧化物，具有兩親性，其有可能與添加的微量成分競(jìng)爭(zhēng)吸附到界面形成混合反膠束，但是其機(jī)理與反應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

測(cè)定了油脂中微量成分DOPC、油酸、-谷甾醇、DAG在SFO中的臨界膠束濃度，并研究其形成的反膠束對(duì)亞麻籽油體系的穩(wěn)定性以及對(duì)生育酚抗氧化活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOPC是形成反膠束的重要組分，其臨界膠束濃度為125 μmol/kg，而油酸、-谷甾醇、DAG在本研究使用的濃度下不會(huì)形成反膠束。與對(duì)照組相比，低濃度微量成分或生育酚對(duì)亞麻籽油體系的熱穩(wěn)定性沒(méi)有顯著影響，而微量成分會(huì)增加氧化產(chǎn)物濃度，并導(dǎo)致生育酚的抗氧化活性降低。反膠束的形成不僅降低油脂熱穩(wěn)定性及氧化穩(wěn)定性，還降低了生育酚的抗氧化活性。一方面反膠束增加了游離脂肪酸的促氧化活性、將脂質(zhì)氫過(guò)氧化物吸引到油水界面處加速脂質(zhì)氧化速率，并限制了-生育酚對(duì)界面的可及性，很難聚集在油水界面，因此降低其抗氧化活性。另一方面反膠束還可能改變了脂質(zhì)氧化鏈傳播過(guò)程中物質(zhì)的質(zhì)量轉(zhuǎn)移途徑，進(jìn)而加速脂質(zhì)氧化，其機(jī)理與反應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。因此，控制反膠束的形成以及調(diào)控反膠束與抗氧化劑的組合對(duì)油脂穩(wěn)定性具有重要意義，此研究為存在反膠束的天然油脂的穩(wěn)定性調(diào)控提供了新思路。