許楊楊，朱力杰,*，劉秀英，李 赫，劉 軍，劉 賀

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.北京工商大學 國家大豆加工產業(yè)技術創(chuàng)新中心，北京 100048；3.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 德州 251200）

多重乳液由Seifriz于1925年首次提出，被稱為“乳液中的乳液”，即乳液以細小液滴的形式存在于另一不相溶的液滴之中。常見的多重乳液主要分為兩類：水包油包水（W/O/W）、油包水包油（O/W/O）。W/O/W乳液是目前常見的一種乳液體系，其分散相本身為油包水（W/O）乳液，內水相W和外水相W因具有相同的極性易相溶。兩步乳化法是制備多重乳液最普遍的方法。與常見的水包油（O/W）乳液相比，W/O/W乳液因具有輸送和控釋生物活性成分、掩蓋不良氣味、降低脂肪含量等優(yōu)點被廣泛地應用于食品、藥品、化妝品等領域。

大豆中的皂苷與蛋白質是大豆油加工的兩類主要副產物，其在脫脂餅粕中含量豐富。大豆皂苷（soyasaponin，Ssa）是由三萜苷元和低聚糖鏈組成的五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷，含有苦澀味，其在大豆中的含量為0.6%～6.2%，具有皂苷一般性質。有研究表明，Ssa除具有抗氧化、降低血糖、抗炎、抗病毒、增強免疫調節(jié)等生理功能外，還具有作為乳化劑、起泡劑的潛能。大豆蛋白是一種多組分混合蛋白，主要由-伴大豆球蛋白（-conglycinin，7S）、大豆球蛋白（glycinin，11S）組成，二者含量占大豆總蛋白含量的80%左右，而大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是目前用量最大、應用最為廣泛的大豆蛋白產品。大豆蛋白含有大量的親水性和疏水性基團，可吸附到油水或者氣-水界面上，降低其表面張力，形成具有粘彈性的蛋白界面膜，阻止其乳化狀態(tài)被破壞，表現出良好的乳化性。目前關于SPI、11S、7S三種蛋白乳化性的研究較為廣泛。Liu Fu等將SPI進行95 ℃、15 min加熱處理，發(fā)現SPI能暴露出更多的疏水基團，形成的乳液更加的穩(wěn)定。Keeratiurai等研究了7S、11S的乳化行為，發(fā)現蛋白質可在油水界面上形成30～40 nm的膜，7S比11S表現出更高的乳化活性。陳碩等的研究結果表明11S在油水界面擴散、展開和重排速率大于7S，調整二者在大豆蛋白中的含量可以改變蛋白在乳液界面上的吸附行為。

綜上所述，以SPI、11S、7S為主要研究對象，探究蛋白質種類對W/O/W乳液穩(wěn)定性的影響，表征乳液的整體穩(wěn)定性、粒徑特性、電位特性、微觀結構，并對其流變學特性和長期穩(wěn)定性的變化情況進行分析，以期達到遮蔽皂苷苦味、運輸生物活性的目的，旨在為皂苷-蛋白穩(wěn)定W/O/W乳液提供一定的理論基礎，提高大豆副產物的應用范圍和利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Ssa（＞80%） 西安通澤生物科技有限公司；聚甘油蓖麻醇酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）山東優(yōu)索化工科技有限公司；低溫脫脂豆粕、SPI（蛋白＞90%） 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；尼羅紅、proclin 950、Florisil分子篩（60～100 目） 美國Sigma公司；長壽花玉米油 市購；其他化學藥品均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

HH-2J數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州雙瑞儀器制造有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機 美國Thermo公司；FJ200-SH高速分散均質機 上海標本模型廠；FB-110S高壓均質機 上海勵途機械設備工程有限公司；Turbiscan穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司；BT-9300激光粒度分析儀 丹東百特儀器有限公司；DiscoveryHR-1流變儀 美國TA公司；OCA-20視頻光學接觸角測量儀 德國Data-physics公司；FV-1000激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司；Nano-ZS90電勢分析儀 英國馬爾文公司。

1.3 方法

1.3.1 7S、11S球蛋白的制備

參考Xu Jing等的方法，略有改動。將粉碎好的大豆脫脂豆粕與去離子水以1∶15的比例混合，攪拌豆粕至完全溶解，之后再加入2 mol/L的NaOH溶液，pH值調至8.5后在45 ℃低速攪拌1 h，過180 目尼龍網。將收集好的過濾液9 000×離心20 min，保留上清液。將亞硫酸氫鈉（0.98 g/L）加入上清液中進行攪拌至完全溶解，之后再加入2 mol/L HCl溶液，將其pH值調節(jié)至6.4。將上述溶液放入4 ℃的冰箱中過夜后6 500×離心20 min，取出底部沉淀即為11S組分。在離心后的上清液中加入0.25 mol/L NaCl溶液，其目的是調節(jié)溶液的離子濃度，之后再加入2 mol/L HCl溶液，pH值調至5。靜置1 h后，溶液4 ℃、9 000×離心30 min，保留上清液。將相同體積的冰水加入上清液中，再用2 mol/L HCl溶液調pH值至4.8，之后4 ℃、6 500×離心20 min，取出沉淀即為7S組分。經計算可知11S、7S的提取率分別為15.51%、9.46%，蛋白質量分數分別為93.9%、96.2%。

1.3.2 W/O/W乳液的制備

參考Zhu Qiaomei等的方法，略有改動。在去離子水中溶解1%（/）Ssa制備成為內水相W；在玉米油中加入3%（/）PGPR，之后在50 ℃加熱攪拌30 min后制成油相O。將內水相W、油相O二者以30∶70進行混合，先使用高速剪切機在18 000 r/min均質4 min，隨即在60 MPa高壓均質得到W/O乳液。在去離子水中溶解1%（/）SPI、11S、7S制備成為外水相W，將外水相W、初乳W/O以50∶50進行混合，先使用高速剪切機7 000 r/min均質2 min，隨后在10 MPa下高壓均質獲得W/O/W乳液。在制備好的W/O/W乳液中加入0.05% proclin。

1.3.3 W/O/W乳液整體穩(wěn)定性測定

Turbiscan 穩(wěn)定分析儀能在不破壞乳液的情況下，通過測量脈沖近紅外光的透散射光和背散射光（backscattering，BS）表征W/O乳液的穩(wěn)定性。該儀器對樣品進行靜置垂直掃描，透過率探測器接收相對于光源180°通過色散的光，背散射探測器接收以45°向后散射的光，經多次掃描獲得能夠對乳液絮凝、上浮等狀態(tài)進行分析的掃描圖譜。采用BS表征乳液的穩(wěn)定性的原因是本實驗制備的W/O乳液不透光。實驗時在機器專用測試瓶中加入20 mL的W/O乳液，之后將其放入多重光機器中開始進行掃描模式，每30 min掃描一次，總共掃描12 h。乳液經過不同儲藏時間后再將其放入儀器中進行連續(xù)掃描1 h，以探究乳液的長期穩(wěn)定性。

BS由式（1）得到：

*由式（2）得到：

式中：為粒子的體積分數/%；為粒子平均直徑/μm；、為米氏理論的光學參數。

通過樣品的穩(wěn)定性動力指數（turbiscan stability index，TSI）評價乳液穩(wěn)定性，TSI曲線斜率越低、TSI值越低，乳液越穩(wěn)定。TSI由式（3）得到：

式中：x為每次背射光強的平均值；為x的平均值；為掃描次數。

1.3.4 W/O/W乳液粒徑的測定

參考Ma Lulu等的方法，略有改動。采用激光粒度分布儀測定W/O/W乳液的粒徑及寬度值。儀器參數設定為：顆粒折射率1.470，吸收指數0.002，水為分散劑，折射率1.330，測定溫度25 ℃。乳液粒徑用體積平均直徑（=∑nd/∑nd）和表面積平均直徑（=∑nd/∑nd）表示，其中n、d分別表示乳液液滴的數量和直徑。乳液液滴尺寸分布的相對寬度用寬度值（Span=（－）/）表示，其中，、、分別為累積分布百分數達到90%、50%和10%處的乳液液滴的體積直徑。每個樣品至少重復測定3 次。

1.3.5 W/O/W乳液流變的測定

采用TA流變儀測定W/O乳液的流變學特性。實驗參數設定為：溫度25 ℃，錐板2°、40 mm，間隙0.1 mm。穩(wěn)態(tài)掃描模式：剪切速率0.1～100 s；振蕩頻率模式：在線性彈性內應變0.5%，頻率0.1～10 Hz。每個樣品至少測定3 次平行。采用冪律模型對數據進行擬合，由式（4）得到：

式中：為剪切應力/Pa；為稠度系數/（Pa·s）；為剪切速率/s；為冪律指數。

1.3.6 W/O/W乳液激光共聚焦的測定

參考Velderrain-Rodríguez等的方法略加改動。取新鮮制備的W/O/W乳液1 mL，加入50 μL 0.1 g/100 mL尼羅紅（丙酮溶解）溶液進行染色。吸取成功染色的溶液（10 μL）滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油封片，之后將其放于激光共聚焦×63油鏡進行觀察。熒光樣品的激發(fā)波長為488 nm的氬/氪離子，掃描密度為512×512，采用LASAF Lite軟件對圖像進行處理。

1.3.7 W/O/W乳液電位的測定

采用電勢分析儀測定W/O/W乳液的電位，將W/O/W乳液樣品稀釋30 倍，測定溫度為25 ℃，測定過程中要緩慢加入樣品防止產生氣泡。每個樣品至少測定3 次。

1.3.8 動態(tài)界面張力測定

去除食用油中少量表面活性劑和雜質是玉米油進行純化的目的。具體方法為：玉米油與Florisil分子篩按照100∶4（mL/g）的比例混合均勻，采用磁力攪拌器攪拌2 h，之后10 000 r/min離心20 min除去沉淀。離心處理3 次，至其與去離子水界面張力30 min內保持恒定值為止。經測試，純化后的玉米油密度為0.916 4 g/cm，油水界面張力為（26.16±0.13）mN/m，測試溫度為25 ℃。

采用滴形張力法測定了蛋白質在油水界面吸附過程中界面張力（）值的變化情況。實驗過程中應注意避免外界環(huán)境振蕩對測試結果產生影響。實驗時將蛋白質水溶液加入注射針（針的外徑為1.83 mm），平衡30 min使其溫度達到25 ℃后向盛有純化玉米油（含0.01% PGPR）的光學玻璃比色杯中注射10 μL的樣品，測定時間為150 min。液滴外形圖像用CCD攝像系統(tǒng)采集，利用系統(tǒng)SCA20軟件進行分析。根據Young-Laplace方程計算在吸附時間（）內蛋白質溶液的界面張力（）變化情況。

1.4 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 W/O/W乳液的整體穩(wěn)定性分析

TSI值可以用來衡量乳液的穩(wěn)定性，一般來說TSI曲線斜率和數值越大表示乳液發(fā)生分離的速度越快，乳液穩(wěn)定性越低。結果表明，W/O/W乳液的TSI值隨著時間的延長呈現不斷增加的趨勢（圖1），說明在12 h內乳液的穩(wěn)定性不斷下降。在放置12 h后，外水相添加SPI、11S、7S的W/O/W乳液，相應TSI值分別為2.12、3.13、3.38，此結果表明SPI構建的W/O/W乳液的穩(wěn)定性最好，7S乳液穩(wěn)定性最差。圖2是蛋白質種類對W/O/W乳液整體穩(wěn)定性的影響。ΔBS的絕對值越小，乳液越穩(wěn)定。光譜圖的左側、中側、右側分別代表乳液瓶的底部、中部、頂部。從圖2可以看出，所有乳液底部的ΔBS隨時間呈現下降趨勢，頂部的ΔBS為上升趨勢，表明乳液出現了上浮現象。SPI乳液中間的ΔBS無明顯變化，表明乳液粒徑大小無明顯變化，12 h后頂部的ΔBS值增加至15%；11S、7S乳液中間的ΔBS有明顯變化，表明液滴遷移速度加快，粒徑大小增加，乳液發(fā)生絮凝或聚合現象，頂部的△BS值分別增加至30%、38%，這與圖1結果一致。

圖1 SPI、11S、7S對W/O/W乳液TSI值的影響（12 h）Fig.1 Effects of SPI,11S and 7S on the TSI value of W/O/W emulsion

圖2 SPI（A）、11S（B）、7S（C）（1%）制備W/O/W的整體穩(wěn)定性Fig.2 Overall stability of W/O/W emulsion prepared with SPI (A),11S (B) or 7S (C)

2.2 W/O/W乳液的粒徑、電位及微觀結構分析

粒徑是乳液生產工藝中最重要的參數，它影響乳液的外貌、質地、貨架期、風味以及穩(wěn)定性。從表1可以看出，SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液的粒徑集中在6 μm附近，且大小存在顯著性差異。從圖3可以看出，液滴中間存在黑色的“小圓圈”，其代表內部小水滴，這與文獻的圖片一致，表明該體系成功地制備了W/O/W乳液。圖片顯示視野中乳液液滴大小不均一，其中11S乳液中的大液滴總體數量較多，其次為SPI，最后為7S，這與粒徑結果一致。

表1 SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液的粒徑、寬度及電位變化Table 1 Particle size,span value and zeta potential of W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S

圖3 制備的W/O/W乳液的激光共聚焦圖Fig.3 Confocal laser scanning micrographs of W/O/W emulsion

Zeta電位可以反映液滴間的帶電性質，是研究乳液物理穩(wěn)定性的一個重要參數。有研究表明，電位的絕對值越大，表明其穩(wěn)定性越高。從表1可以看出，SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液的電位之間存在顯著差異且SPI乳液電位的絕對值最大，說明用SPI制備的W/O/W乳液比11S、7S制備的乳液具有更高的穩(wěn)定性。

2.3 W/O/W乳液的流變學特性

乳液的流變學性質不僅可以為乳液穩(wěn)定性和微觀結構提供有用的信息，還可以為在乳液的加工、處理、儲存和管道運輸中對所涉及設備的設計、選擇和操作提供重要方向。在0.1～100 s剪切速率下研究了SPI、11S、7S構建的W/O/W乳液的流動行為，如圖4所示。隨著剪切速率的增加W/O/W乳液黏度不斷降低，當剪切速率過高時，黏度趨于平緩，表現為剪切稀化行為。文獻中也有類似的結果，如Liu Jinning等的研究表明W/O/W雙乳液的流變學測定為剪切稀化行為。表2為采用冪律模型對W/O/W乳液數據進行的非線性回歸分析。其中，為稠度系數，與黏度測定值相等；為流動指數，表示流體偏離牛頓流體的程度，當=1時為牛頓流體，當＜1時且乳液黏度隨剪切速率的增加而降低時，屬于非牛頓流體的假塑性流動。從表2可知，SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液均為非牛頓流體（＜1），黏度值分別為（0.029±0.005）、（0.005±0.000）、（0.003±0.005）Pa·s，SPI黏度顯著大于11S、7S。有研究表明，乳液較高黏度可抑制乳液的聚合和沉淀速率，增強其穩(wěn)定性，這與乳液整體穩(wěn)定性的研究結果一致。圖5為在變頻速率下，乳液的儲能模量（’）和損耗模量（’’）的變化，其中’代表彈性，’’代表黏性。研究結果表明，隨著頻率的增加，乳液’、’’呈現上升的趨勢，表明乳液的黏彈性增加，且’、’’之間存在交叉點頻率，在交叉點之前，’’＞’表現為黏性為主，反之則以彈性為主。同時，圖5直觀地表明了乳液黏彈性大小為SPI＞11S＞7S。

圖4 SPI、11S、7S制備W/O/W乳液的黏度變化Fig.4 Changes in viscosity of W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S

表2 SPI、11S、7S對W/O/W乳液冪律模型擬合參數的影響Table 2 Effects of SPI,11S and 7S on power law model parameters for W/O/W emulsion

圖5 SPI、11S、7S制備W/O/W乳液的G’和G’’隨頻率的變化Fig.5 Storage (G’) and loss (G’’) modulus versus frequency for W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S

乳液黏度可以反映乳液內在形態(tài)與粒子間的相互作用，有研究表明多重乳液中水分子的遷移會造成乳液黏度的變化。由圖6可得，貯藏時間延長，SPI乳液的黏度呈現下降趨勢，7S及11S乳液黏度變化趨勢均表現為先降低后增加。結合后續(xù)長期穩(wěn)定性等實驗結果可以發(fā)現，基于SPI制備的W/O/W乳液其穩(wěn)定性強于7S及11S乳液，而體系黏度與乳液穩(wěn)定性存在一定關系。推測7S/11S乳液中的水分子較SPI乳液更易從內向外遷移，進而改變了其連續(xù)相和分散相的比例，造成乳液黏度下降，之后雙重乳液發(fā)生破裂又引起其黏度上升。

圖6 W/O/W乳液黏度在48 h內的變化Fig.6 Changes in W/O/W emulsion viscosity during storage up to 48 h

2.4 W/O/W乳液的界面吸附行為

界面流變學（界面張力、界面黏彈性）與乳液的穩(wěn)定性存在一定的聯系，界面張力值越低，在能量輸入過程中破裂乳液液滴所需要的能量越少，形成的乳液粒徑越小，其穩(wěn)定性越好。圖7為SPI、11S、7S與PGPR復合體系在油水界面的張力值隨吸附時間的變化情況。圖7A結果表明，蛋白質與PGPR的界面張力隨著時間延長呈顯著下降趨勢，表明界面上乳化劑的吸附量增加。SPI的界面張力衰減曲線值最小，其次是11S，再次為7S。觀察7S的界面張力衰減曲線，發(fā)現有曲折點，這可能與蛋白質結構出現了明顯的去折疊有關。圖7B顯示，在吸附150 min后，SPI、11S、7S的界面張力值分別為4.07、5.18、7.18 mN/m，表明在相同的時間下SPI的界面張力最低，界面張力的降低會使得乳液液滴粒徑變小，從而有利于乳液的穩(wěn)定性。由于PGPR與蛋白質均為兩親性分子，在界面上易發(fā)生疏水相互作用，進而協(xié)同降低界面層的張力值，而界面張力的降低程度主要取決于蛋白質的分子質量與結構。

圖7 SPI、11S、7S與PGPR復合體系在油水界面的界面張力（γ）隨吸附時間的變化（A）及吸附150 min后復合體系γ的變化（B）Fig.7 Interfacial tension (γ) of composite systems of SPI,11S or 7S with PGPR at the oil-water interface as a function of adsorption time (A) and changes in γ after adsorption for 150 min (B)

2.5 W/O/W乳液的長期穩(wěn)定性

為探究不同蛋白質構建的W/O/W乳液長期穩(wěn)定性，將其在室溫下放置15 d。如圖8A所示，15 d后對乳液外觀進行觀察，發(fā)現所有樣品瓶底部均有水分析出，說明此時乳液穩(wěn)態(tài)失衡，頂部出現明顯的油析。其中就分層率而言，7S的分層率最高，SPI的最低。測定W/O/W乳液在15 d內TSI變化（圖8B），結果表明隨著時間的延長，乳液TSI值不斷變大，表明乳液在放置過程中穩(wěn)定性不斷降低。其中就曲線斜率而言，SPI的曲線斜率最低，11S和7S相差較小。15 d之后，SPI、11S、7S制備W/O/W乳液的TSI值分別為21.51、24、25.50，表明SPI制備的W/O/W乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于11S、7S。這與界面張力、流變等結果一致。

圖8 SPI、11S、7S制備W/O/W乳液15 d后的直觀圖（A）和15 d內TSI的變化（B）Fig.8 Visual appearance of W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S after 15 days of storage (A) and changes in TSI during the 15-day storage period (B)

3 結論

采用兩步乳化法，基于Ssa及SPI、11S、7S成功構建出較為穩(wěn)定的W/O/W乳液，發(fā)現隨著貯藏時間的延長，乳液的TSI值呈上升趨勢；SPI構成乳液的上浮率最小，各組乳液粒徑集中在6 μm附近；電位絕對值的順序為SPI＞11S＞7S；乳液體系表現出假塑性剪切稀化行為，SPI乳液的黏度值最大；在相同蛋白質量分數下（1%），SPI制備的乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于11S、7S。本研究探索了以Ssa、蛋白為原料構建W/O/W型乳液的可行性，為二者在新型乳液基食品中的進一步應用打下基礎。