梁書寶，李心怡，丁以春，李小靜

基于瘢痕疙瘩浸潤性生長的特性，故有提出瘢痕疙瘩腫瘤源性學(xué)說[1]；腫瘤壞死因子-α刺激基因-6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6，TSG-6)在瘢痕疙瘩中參與多種炎性反應(yīng)的抗炎基因調(diào)節(jié)，能夠抑制人病理性瘢痕成纖維細胞的增殖并促進其凋亡[2-3]，但其上游調(diào)控機制尚不明確；N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A) RNA甲基化是指發(fā)生在mRNA腺嘌呤(A)第6位N原子上的一種轉(zhuǎn)錄后修飾方式，而m6A甲基化過程是可逆性的：去甲基化酶的作用是催化m6A去除甲基，包括去甲基化酶肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated, FTO)和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶alkB同源物5(α-ketoglutarate dependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5)；甲基化酶的作用為促進m6A甲基化，包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase like 3,METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase like 14,METTL14)和腎母細胞瘤1-結(jié)合蛋白(Wilms′ tumor 1-associating protein, WTAP)[4-6]。但是目前基于TSG-6 mRNA的m6A RNA甲基化調(diào)控機制在瘢痕疙瘩中的作用及其機制研究在國內(nèi)外均未見報道。該研究通過對瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中TSG-6 mRNA甲基化水平及FTO表達水平的檢測，為瘢痕疙瘩的發(fā)病機制研究和防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織均來自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及病房患者術(shù)中切除，隨機選取新鮮切除組織分為實驗組(瘢痕疙瘩組織)和對照組(瘢痕疙瘩患者植皮手術(shù)供區(qū)或瘢痕疙瘩周圍修剪的正常皮膚)；所取標本均已獲得患者同意并簽字確認，所有標本均無感染及潰瘍且未接受過任何藥物及放射治療。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Triton X-100購自北京索萊寶公司；Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555標記驢抗兔IgG購自上海碧云天生物技術(shù)公司；總RNA提取試劑盒購于德國Qiagen公司；m6A抗體購自德國Synaptic Systems公司；生物素RNA標記混合液購自瑞士Roche公司；羊抗兔HRP標記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鏈霉親和素磁珠、熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫熒光染色 分別收集人瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織，采用組織塊貼壁法提取并培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞；成纖維細胞用PBS清洗后用4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100透化處理10 min，滴加1%牛血清白蛋白封閉液封閉1 h；加FTO(1 ∶100)和TSG-6(1 ∶100)抗體放在濕盒里，放置4 ℃過夜；將細胞與Alexa Fluor 555標記驢抗兔(1 ∶500)和Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠(1 ∶500)在室溫下避光孵育1 h。防淬滅封片劑與DAPI 1 ∶500稀釋封片，-20 ℃冰箱保存，熒光顯微鏡拍片。使用Image J軟件分析平均熒光強度。

1.3.2生物素標記TSG-6 RNA pulldown實驗

1.3.2.1TSG-6 RNA生物素標記 將TSG-6 cDNA構(gòu)建到pSPT19載體上；將含有pSPT19-TSG6的質(zhì)粒經(jīng)XbaI內(nèi)切酶作用后作為TSG-6正義鏈，將含有pSPT19-TSG6的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI內(nèi)切酶作用后作為TSG-6反義鏈 ，然后去除未整合的核苷酸；在RNA聚合反應(yīng)中加入2 μl生物素RNA標記物以形成TSG-6 RNA生物素標記，最后獲得的TSG-6 RNA用RNeasy迷你包純化。

1.3.2.2組織蛋白樣品制備 取適量組織加入1 ml RIPA裂解液和10 μl蛋白酶抑制劑，制備組織蛋白樣品。

1.3.2.3生物素RNA預(yù)處理 取3 μg標記的RNA至PCR管，PCR儀加熱90 ℃、2 min，然后置冰上2 min，最后加4 μl RNA凝膠加樣緩沖液(5×)室溫靜置20 min。

1.3.2.4RNA pulldown 取1 mg蛋白液及預(yù)處理的生物素RNA加入EP管，4 ℃下?lián)u床作用1 h；取30 μl鏈霉親和素磁珠混懸液放入經(jīng)DEPC處理過的新EP管中并置于磁力架上，用RIPA裂解液洗滌2次。將RNA-蛋白混合液加入有磁珠的EP管中，室溫孵育1 h；使用磁力架吸附磁珠，洗滌磁珠3次，去除非特異結(jié)合蛋白。樣品用10%膠進行SDS-PAGE電泳，隨后進行轉(zhuǎn)膜，使用m6A抗體進行Western blot檢測。使用Image J軟件分析灰度值。

1.3.3qPCR檢測瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中去甲基化酶和甲基化酶mRNA表達水平 分別收集人瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織，提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA；引物根據(jù)GenBank中FTO、ALKBH5、MEITTL3、METTL14、WTAP基因序列設(shè)計(表1)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：PCR擴增為95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、45 s，40個循環(huán)。熔解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software進行分析。

表1 RT-PCR 基因序列設(shè)計(5′-3′)

1.3.4Western blot法檢測瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中去甲基化酶和甲基化酶蛋白表達水平 分別收集人瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織，裂解提取總蛋白，以BCA法蛋白定量。制備好的蛋白樣品用12%的膠進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，按METTL3 1 ∶1 000、FTO 1 ∶1 000、β-actin 1 ∶1 000稀釋抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后加入1 ∶10 000稀釋的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后與化學(xué)發(fā)光底物孵育5 min，曝光、顯影、定影。用β-actin作內(nèi)參驗證蛋白含量。使用Image J軟件分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析，樣本間差異比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞免疫熒光染色結(jié)果對TSG-6和FTO進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組TSG-6(紅色)染色強度較低，而FTO(綠色)染色強度較高；比較平均熒光強度,實驗組TSG-6的表達水平低于對照組(t=6.360,P=0.003 1)，而FTO的表達水平高于對照組(t=9.979,P=0.000 6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 免疫熒光實驗檢測TSG-6和FTO的表達A：FTO熒光染色 ×400；B：TSG-6熒光染色 ×400；C：TSG-6平均熒光強度；D：FTO平均熒光強度；與對照組比較：**P<0.01,***P<0.001

2.2 TSG-6 mRNA的m6A修飾水平檢測結(jié)果對RNA pulldown試驗得到的蛋白進行Western blot檢測，將從組織直接提取的蛋白樣品作為陽性對照，用TSG-6正義鏈探針pulldown得到的結(jié)果作為陰性對照；用TSG-6反義鏈探針pulldown得到的蛋白檢測結(jié)果為陽性，并對得到的樣本蛋白進行RNA酶處理，降解mRNA得到目標蛋白；用m6A抗體對各組樣本進行Western blot檢測，通過讀取條帶灰度值分析相對表達水平，實驗組TSG-6 mRNA的m6A甲基化水平低于對照組(t=8.101，P=0.001 3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 Western blot實驗檢測TSG-6 mRNA中m6A的表達1：陽性對照；2：陰性對照；3：TSG-6反義鏈探針pulldown得到的m6A蛋白；-：未加RNA酶；+：添加RNA酶；與對照組比較：**P<0.01

2.3 qPCR及Western blot法檢測瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中甲基化酶和去甲基化酶結(jié)果qPCR檢測實驗組和對照組中m6A RNA的甲基化酶(METTL3、METTL14、WTAP)、去甲基化酶(FTO、ALKBH5)和甲基化結(jié)合蛋白(YTHDF1、YTHDF2)的表達水平，結(jié)果顯示，實驗組中FTO mRNA表達水平高于對照組(t=19.32，P=0.002 7)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)；Western blot檢測結(jié)果顯示，實驗組中FTO蛋白表達水平高于對照組(t=10.90，P=0.000 4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而METTL3蛋白表達水平較對照組的差異不明顯(t=0.069，P=0.948 3)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

圖3 qPCR實驗檢測RNA m6A相關(guān)酶的表達A：FTO；B：METT14；C：WTAP；D：METTL3；E：ALKBH5；F：YTHDF1；G：YTHDF2；與對照組比較：**P<0.01

圖4 Western blot實驗檢測FTO和METTL3的表達與對照組比較：***P<0.001

3 討論

瘢痕疙瘩是由于皮膚外傷等原因造成的良性纖維過度增生性疾病，瘢痕疙瘩不僅影響美容，且會導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，包括疼痛、瘙癢、觸覺異常、功能障礙等。有文獻[7]報道，相關(guān)腫瘤靶向治療方法在瘢痕疙瘩的治療中已取得不錯的效果，如熱休克蛋白90等。瘢痕疙瘩發(fā)病機制與良性腫瘤發(fā)病機制具有相似之處，因此，借鑒腫瘤浸潤性生長分子生物學(xué)、遺傳生物學(xué)和細胞生物學(xué)的特性，探討并揭示瘢痕疙瘩浸潤性生長的機制，可為瘢痕疙瘩的臨床治療提供新的思路和方向。

TSG-6基因位于人染色體2q23.3，其編碼蛋白由277個氨基酸組成，可以減輕炎性反應(yīng)，降低炎癥對機體的損傷[8]。2011年Tan et al[9]首次證明瘢痕疙瘩組織中的TSG-6表達水平低于無瘢痕修復(fù)皮膚組織。Li et al[10]研究表明TSG-6可導(dǎo)致p21、cyclinD1、NF-κB、Bcl-2、Bax、caspase-3等相關(guān)基因表達的改變，抑制TGF-β/smad等炎癥反應(yīng)相關(guān)信號通路，促進Fas/FasL凋亡通路，進一步說明TSG-6對瘢痕疙瘩的形成具有抑制作用。m6A RNA甲基化是真核生物mRNA中最豐富的表觀遺傳修飾，可以影響RNA代謝，如mRNA的穩(wěn)定性和剪接、翻譯效率以及微小RNA加工等，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著調(diào)節(jié)作用[11-13]。目前有研究[14]報道提出m6A RNA甲基化會影響胚胎時期皮膚的發(fā)生發(fā)展，在皮膚形態(tài)發(fā)生過程中，通過METTL3使得mRNA甲基化影響胚胎皮膚形態(tài)的選擇，同時有報道揭示了METTL3在皮膚鱗狀細胞癌樣本中的表達上調(diào)[15]。但是目前尚未見m6A在瘢痕疙瘩中的作用及其機制研究。

本研究首先對實驗組和對照組中TSG-6的表達進行檢測，結(jié)果表明實驗組中的TSG-6蛋白表達水平低于對照組；進一步對實驗組和對照組中的TSG-6 mRNA甲基化水平進行檢測，結(jié)果表明實驗組中TSG-6 mRNA的m6A修飾水平低于對照組；這一結(jié)果證實了m6A RNA甲基化參與TSG-6的表達，影響了瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展。而m6A RNA甲基化過程可由去甲基化酶和甲基化酶調(diào)控，本研究在實驗組和對照組中進行相關(guān)酶的檢測，結(jié)果表明在實驗組中FTO mRNA表達水平和FTO蛋白表達水平均高于對照組；細胞免疫熒光亦提示實驗組中的FTO蛋白表達水平高于對照組；上述實驗結(jié)果表明，在瘢痕疙瘩組織中，由于FTO的表達水平升高引起TSG-6 mRNA的m6A去甲基化水平升高，導(dǎo)致TSG-6表達水平下降，進而削弱了對瘢痕疙瘩的抑制作用。