劉穎超， 程 瀟， 宋麗麗， 張 宇

(中國海洋大學海洋生命學院， 山東 青島 266003)

生物在長期演化過程中，形成了由一系列基因家族和反應通路組成的化學防御系統(tǒng)，以抵御環(huán)境中異生物質(zhì)如微生物產(chǎn)物、重金屬、多環(huán)芳烴、植物毒素等的傷害。其中，化學感受器是化學防御系統(tǒng)的重要組成，這些蛋白的功能是感知異生物質(zhì)，并啟動生物轉(zhuǎn)化酶基因和轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達，以減除異生物質(zhì)的毒害[1-2]。

芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)和芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)都是重要的化學感受器，同屬于bHLH-PAS(Basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim)轉(zhuǎn)錄因子超家族[3-6]，該家族成員的特征是具有bHLH和PAS功能域。AHR是配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，可被多種內(nèi)源性或外源性配體激活，包括多環(huán)芳香烴(PAHs，如苯并芘、苯并蒽)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代多環(huán)碳氫類化合物(如二噁英TCDD、聯(lián)二苯)、吲哚類等[7-10]。經(jīng)典信號通路中，AHR能夠與ARNT形成異二聚體并啟動多種生物轉(zhuǎn)化酶基因的表達。未出現(xiàn)配體時，AHR存在于細胞質(zhì)中并處于失活狀態(tài)，與一些分子伴侶穩(wěn)定結(jié)合，包括兩分子的90 kDa熱激蛋白90(Heat shock protein 90， Hsp90)、p23以及AHR相互作用蛋白(AIP/XAP2/Ara9)。當AHR與TCDD、PCBs等配體結(jié)合后，AHR被激活并與分子伴侶解離，AHR/Hsp90復合體進入細胞核。在細胞核中，ARNT取代Hsp90，與AHR形成異二聚體，識別并結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)域的應答元件(AHRE、DRE或XRE)，從而啟動細胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYPs)家族基因等下游基因的轉(zhuǎn)錄。其中，CYP1s是研究最充分的AHR靶基因，其參與多種AHR配體的代謝激活和解毒[11-14]，該經(jīng)典通路也被稱為AHR-CYP信號通路。

在脊椎動物中，AHR-CYP信號通路已明確是參與化學防御的重要機制。而無脊椎動物是否同脊椎動物一樣，依靠AHR-CYP信號通路抵御外源有毒物質(zhì)的傷害仍有爭議[5,15-17]。Hahn[5]認為，脊椎動物AHR通過基因復制致使該基因獲得能夠與二噁英等外源物質(zhì)結(jié)合的能力。而無脊椎動物的原型AHR主要參與動物發(fā)育過程，不具有與這些外源異生物結(jié)合的能力[14]。然而，也有研究表明，在苯并(a)芘、PCB126和TBT這些典型AHR配體的刺激下，劍水蚤(Tigriopusjaponicus)[16]和櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[17]的AHR和ARNT基因均表達上調(diào)，且櫛孔扇貝的CYP1A1以及雌激素受體基因的表達也被激活，暗示這兩種海洋無脊椎動物中可能存在潛在的AHR-CYP信號通路。

頭索動物文昌魚，位于脊椎動物和無脊椎動物的的進化節(jié)點上，常作為研究脊椎動物起源的模式動物。目前，對文昌魚AHR和ARNT在化學防御系統(tǒng)中的作用仍缺少了解，文昌魚中是否存在類似脊椎動物的AHR-CYP信號通路也仍不清楚。本研究中克隆鑒定了青島文昌魚(Branchiostomajaponicum)ahr和arnt基因，并對這2個基因的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化關(guān)系展開了分析，通過qRT-PCR進行了組織表達分析，以及類二噁英PCB126脅迫后的表達分析。此外，還通過構(gòu)建原核表達載體，獲得了青島文昌魚AHR功能域和ARNT重組蛋白，并利用ELISA結(jié)合實驗，分析了青島文昌AHR功能域和ARNT的結(jié)合作用。本研究為深入探索文昌魚AHR和ARNT在化學防御系統(tǒng)中的作用奠定了基礎(chǔ)，豐富和拓展對AHR-CYP信號通路進化方面的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

實驗所用文昌魚處于繁殖季節(jié)(5月下旬—7月中旬)，取自青島市沙子口附近海域，室溫避光養(yǎng)殖在裝有沙子和海水的水箱中，用氣泵保證氧氣供給，每天喂食螺旋藻至實驗前取用。本研究所進行的動物實驗均符合山東省實驗動物管理局倫理委員會(許可證號:SD2007695)。PCB126(3,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯，純度>99%)購自Sigma公司。

1.2 文昌魚ahr和arnt基因克隆和測序

實驗前三天停止喂文昌魚，排空其消化道，取10條文昌魚放入研缽并倒入液氮，將魚研磨成粉末并轉(zhuǎn)入RNA專用EP管中(盛有200 μL的TRIZOL試劑)，繼續(xù)研磨使其呈勻漿態(tài)，補足1 mL的TRIZOL試劑，得到的樣品使用Total RNA Kit Ⅰ試劑盒(生產(chǎn)商：Omega Bio-Tek, Norcross, Georgia, USA)，按照說明書步驟進行總RNA的提取。使用Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書步驟對RNA進行反轉(zhuǎn)錄及cDNA合成。擴增文昌魚ahr和arnt基因(分別命名為Bjahr和Bjarnt)的全長開放閱讀框(ORFs)的方法：首先，在青島文昌魚轉(zhuǎn)錄組(未公布數(shù)據(jù))中BLAST搜索得到青島文昌魚ahr和arnt基因候選序列，利用Primer5軟件設(shè)計兩組引物進行PCR擴增，引物序列為：ahr-s：5’-AGTTCGGACGGGATCGCTT-3’，ahr-as：5’-GCACTTCACGGCACAACCTTTA-3’,arnt-s：5’-GACTGCTTAGCCCATCATCGT-3’,arnt-as：5’-TATGCCACATCAACAGACTTTCC -3’；其次，擴增產(chǎn)物用凝膠提取試劑盒(生產(chǎn)商：Omega Bio-Tek, Norcross, Georgia, USA)進行純化，并將回收產(chǎn)物與pGEM-T載體(生產(chǎn)商：Promega, Madison, Wisconsin, USA)連接；最后，連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，取陽性克隆株送上海桑尼生物科技有限公司進行Bjahr和Bjarnt測序。

1.3 序列分析和結(jié)構(gòu)預測

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Ensemble數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)及UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)進行同源序列檢索。利用DNASTAR軟件預測ORF序列，基因編碼的氨基酸序列，預測蛋白的分子量(MW)以及等電點(pI)。通過在線分析軟件SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白序列的結(jié)構(gòu)域以及該蛋白序列的信號肽序列。蛋白的三級結(jié)構(gòu)通過SWISS MODEL網(wǎng)站(http://swissmodel.expasy.org/)，分別以人類AHR和ARNT蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為模板進行預測。利用DNASTAR軟件中MegAlign下的ClustalW進行蛋白多序列比對。使用MEGA6.0軟件以鄰接法(NJ)建構(gòu)系統(tǒng)發(fā)生樹，Bootstrap 值設(shè)為1 000，所用序列編號見表1、2。

表1 AHR系統(tǒng)進化樹分析所用序列編號Table 1 AHR sequences used in phylogenetic analysis

表2 ARNT系統(tǒng)進化樹分析所用序列編號Table 2 ARNT sequences used in phylogenetic analysis

1.4 基因表達分析

為檢測Bjahr和Bjarnt在文昌魚不同組織的表達情況，從性成熟的青島文昌魚中提取多種組織，包括腸、鰓、肝盲囊、肌肉、脊索、卵巢和精巢。將不同組織樣品用TRIZOL研磨固定后，使用上述提到的RNA試劑盒法進行總RNA的提取，用TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser Real-time專用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。用Primer5軟件設(shè)計Bjahr和Bjarnt的qRT-PCR 引物(見表3)，以文昌魚各組織cDNA為模板，文昌魚β-actin為內(nèi)參基因，用ABI7500Real-time PCR儀進行qRT-PCR實驗。反應程序設(shè)定為：(1)1個循環(huán)：95 ℃ 15 s；(2)40個循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s。使用2-ΔΔCt方法來計算基因相對β-actin的表達量。使用Graphpadprism5軟件對實驗結(jié)果進行作圖。

表3 qRT-PCR所用引物序列Table 3 Sequences of primers used in qRT-PCR

1.5 污染物PCB126脅迫實驗

將PCB126(3,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯，純度>99%)粉末溶解到DMSO中，溶解后的PCB126溶液加入處理組海水中，使PCB126終濃度為30 nmol/L。對照組海水中加入與處理組等量且濃度低于1%的DMSO。將文昌魚放入處理組海水和對照組海水中，分別于脅迫后6、12、24、48和72 h，每組各取10條文昌魚進行肝盲囊組織采集，按照上述方法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qRT-PCR實驗檢測Bjahr、Bjarnt、cyp1、cyp3、gst和sult1α的表達情況。實驗中用到的引物見表3。

1.6 原核表達載體構(gòu)建

由于AHR難以純化獲得完整的體外重組蛋白[18]，作者對文昌魚AHR的bHLH、PAS(A)和PAS(B)功能域部分進行了體外表達和純化。在Bjahr功能域兩端設(shè)計分別帶有HindⅢ和XholⅠ酶切位點的引物，引物序列如下：P1-F: 5’-CCCAAGCTTGGAACCCC AGTAAGCGGCACC-3’; P1-R: 5’-CCGCTCGAGTCTCATCAGG CTGGCATGT-3’，下劃線示酶切位點。將PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒表達載體pET-28a上，得到重組表達質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，取陽性克隆株測序以確認成功構(gòu)建pET-28a/ahr原核表達載體。為構(gòu)建Bjarnt原核表達載體，在Bjarnt的ORF兩端設(shè)計分別帶有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位點的引物，引物序列如下：P2-F：5’-CCGGAATTCATGTCGTCGGTGACCAC-3’；P2-R：5’-CCGCTCGAGTTTACTCGGAGAAGGTTGT-3’，下劃線表示酶切位點。按上述同樣方法，成功構(gòu)建pET-28a/arnt原核表達載體。

1.7 重組蛋白的表達和純化

將表達載體轉(zhuǎn)化入表達菌Transetta(DE3)中，挑選陽性菌株接種到LB液體培養(yǎng)基(Kan)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約6 h后，向菌液中加入終濃度0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，28 ℃振蕩培養(yǎng)8 h(文昌魚AHR與ARNT均在此條件下誘導表達效果最佳)。將誘導表達的菌液4 ℃，5 000g離心20 min，棄上清，向沉淀加入30 mL裂解液(AHR調(diào)至pH=6.8，ARNT調(diào)至pH=8)，用槍吹打重懸，超聲破碎后，取出菌液4 ℃，12 000g離心25 min，分別取上清和包涵體樣品，進行SDS-PAGE電泳檢測，檢測顯示AHR和ARNT均在包涵體中表達較多。對包涵體進行洗滌和溶解后，使用鎳柱進行純化，然后用含不同濃度咪唑的溶解液梯度洗脫鎳柱。對上樣前的蛋白、上樣后的蛋白以及不同濃度咪唑洗脫后收集的樣品進行SDS-PAGE檢測，確定重組蛋白的最適洗脫濃度。選擇孔徑為3.5 kDa的透析袋進行透析。將透析袋放在1 L含有10 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L EDTA的溶液中煮沸30 min，然后向透析袋中注入蛋白溶液，用透析夾夾緊袋口。依次將透析袋放入預冷的透析液(Ⅰ～Ⅵ)中4 ℃透析8 h，磁力攪拌器緩慢攪拌。后于預冷透析液Ⅶ中透析8 h，透析液Ⅶ需要重復透析2次。透析結(jié)束后，將透析袋中的液體在4 ℃，12 000g離心20 min，上清即為復性成功的重組蛋白溶液，通過超濾的方法濃縮蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.8 ELISA結(jié)合實驗

將ARNT用PBS稀釋至100 μg/mL，取50 μL加到96孔酶標板中，于25 ℃培養(yǎng)箱里過夜后，再放入60 ℃培養(yǎng)箱固定30 min。向酶標板加入1 mg/mL的BSA封閉液200 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育封閉2 h，再用PBST(100 mLPBS+500 μL Tween-20)進行洗板。用PBS將生物素標記的AHR梯度稀釋為0、2、4、10、20、40、60、80、100、130、160 和200 μg/mL。取50 μL的各個梯度的AHR加入到含有ARNT的各個孔里(每個樣品設(shè)置3個平行)，室溫孵育反應3 h。將生物素標記的BSA設(shè)置同樣的濃度梯度作為對照組。PBST洗板后，加入100 μL的1∶4 000稀釋的帶有HRB標記的鏈霉素室溫孵育1 h，PBST再次洗板。加入75 μL顯色液(51.4 mmol/L Na2HPO4，24.3 mmol/L的檸檬酸，0.045%H2O2，0.4 mg/mL的鄰苯二胺)，放入37 ℃培養(yǎng)箱約10～30 min，加入25 μL終止液(2 M H2SO4)終止反應。用酶標儀測定各孔的A492的OD值。為檢測PCB126是否能促進AHR和ARNT的結(jié)合，用DMSO將PCB126 (3,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯，純度>99%) 粉末稀釋至終濃度2.5 μmol/L，重復上述步驟并在AHR和ARNT室溫孵育階段加入1 μL稀釋的PCB126，在BSA對照組中也加入同量的PCB126，在溶劑對照組中加入等量的DMSO。

2 結(jié)果

2.1 Bjahr基因克隆鑒定和系統(tǒng)進化分析

青島文昌魚ahr基因的開放閱讀框(ORF)長為2 286 bp，編碼一個由760個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(見圖1), 預測其分子量為85.3 kDa，等電點(pI)為8.38。通過SMART在線軟件進行蛋白結(jié)構(gòu)預測顯示該蛋白共有四個功能域，無信號肽。第28～83位氨基酸為HLH結(jié)構(gòu)域，110～176位氨基酸為PAS結(jié)構(gòu)域，第264～333位氨基酸為PAS結(jié)構(gòu)域，第339～380位氨基酸為PAC結(jié)構(gòu)域(見圖2(a))。因為文昌魚AHR具有該家族特征功能域PAS和HLH，故屬于bHLH-PAS家族。三維結(jié)構(gòu)預測顯示青島文昌魚AHR蛋白結(jié)構(gòu)與人AHR蛋白結(jié)構(gòu)相似(見圖2(b))。這些結(jié)果表明所獲得的基因正是ahr基因，因此將它命名為Bjahr。

(功能域HLH、PAS和PAC用紅色框標注。Domain HLH, PAS and PAC were indicated by red boxes.)圖1 文昌魚Bjahr基因的核酸序列與氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Bjahr

圖2 BjAHR蛋白的結(jié)構(gòu)域(a)和利用蛋白結(jié)構(gòu)同源建模法預測的BjAHR分子模型，其與人類AHR同源蛋白的三維結(jié)構(gòu)非常相似(b)Fig.2 Domains of BjAHR (a) and molecular model of BjAHR predicted by homology modeling of protein structure，which is closely similar to the 3D structure of human AHR homologues (b)

系統(tǒng)進化分析顯示，青島文昌魚AHR與佛羅里達和白氏文昌魚的AHR聚為一支，位于脊椎動物和無脊椎動物之間(見圖3)。其他無脊椎動物AHR聚為一支，位于進化樹的底部。脊椎動物中，魚類往往擁有2個AHR，即AHR1和AHR2。進化樹顯示脊椎動物的AHR和魚類AHR2聚在一起，其中魚類AHR2單獨聚為一亞支。該進化樹很好的反映了AHR在所選物種中的進化關(guān)系。

(使用MEGA 6.0軟件的鄰接(NJ)法進行進化樹構(gòu)建。每個節(jié)點的可靠性經(jīng)過1 000次重復檢驗，節(jié)點處數(shù)值表示檢驗后的bootstrap支持率(%)。建樹所用序列的登錄號列在表1中。The phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0 using the amino acid-based Neighbor-Joining (NJ) algorithm. The reliability of each node was estimated by bootstrapping with 1 000 replications. The numbers shown at each node indicate the bootstrap values (%). Accession numbers for sequences used are listed in Table 1.)圖3 AHR系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic tree of AHR

2.2 Bjarnt基因克隆鑒定和系統(tǒng)進化分析

青島文昌魚arnt基因的開放閱讀框(ORF)長為2 142 bp，編碼由714個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(見圖4)，其分子量推斷為78.6 kDa，等電點為6.46。結(jié)構(gòu)域預測顯示，該蛋白共有四個結(jié)構(gòu)域，無信號肽。第76～129位氨基酸為HLH結(jié)構(gòu)域，第144～211位氨基酸為PAS結(jié)構(gòu)域，第328～398位氨基酸為PAS結(jié)構(gòu)域，第405～448位氨基酸為PAC結(jié)構(gòu)域(見圖5(a))。與AHR一樣，ARNT也屬于bHLH-PAS超家族。蛋白三維結(jié)構(gòu)預測顯示，文昌魚ARNT蛋白結(jié)構(gòu)與人ARNT的結(jié)構(gòu)也十分相似(見圖5(b))。這些結(jié)果表明所獲得的基因正是arnt基因，因此將它命名為Bjarnt。

(功能域HLH、PAS和PAC用紅色框標注。Domain HLH, PAS and PAC were indicated by red boxes.)圖4 文昌魚Bjarnt基因的核酸序列與氨基酸序列Fig.4 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Bjarnt

圖5 BjARNT蛋白的結(jié)構(gòu)域(a)和利用蛋白結(jié)構(gòu)同源建模法預測的BjARNT分子模型，其與人類ARNT同源蛋白的三維結(jié)構(gòu)非常相似(b)Fig.5 Domains of BjARNT (a) and molecular model of BjARNT predicted by homology modeling of protein structure，which is closely similar to the 3D structure of human ARNT homologues (b)

系統(tǒng)進化分析顯示，青島文昌魚ARNT與佛羅里達文昌魚ARNT單獨聚為一支，并且與無脊椎動物ARNT聚在一起，位于進化樹的底部，表明文昌魚ARNT較為原始(見圖6)。脊椎動物通常擁有兩個ARNT，即ARNT1和ARNT2。進化樹顯示脊椎動物的ARNT1和ARNT2聚在一起，其中ARNT2單獨聚為一亞支。該進化樹很好的反映了ARNT在所選物種中的進化關(guān)系。

(使用MEGA 6.0軟件的鄰接(NJ)法進行進化樹構(gòu)建。每個節(jié)點的可靠性經(jīng)過1 000次重復檢驗，節(jié)點處數(shù)值表示檢驗后的bootstrap支持率(%)。建樹所用序列的登錄號列在表2中。The phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0 using the amino acid-based neighberjoinning (NJ) algorithm. The reliability of each node was estimated by bootstrapping with 1 000 replications. The numbers shown at each node indicate the bootstrap values (%). Accession numbers of sequences used are listed in Table 2.)圖6 ARNT系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic tree of ARNT

2.3 組織特異表達分析

利用qRT-PCR分別檢測了Bjahr和Bjarnt在青島文昌魚不同組織中的表達模式(見圖7)。Bjahr在所選取的7種組織中均有表達，在卵巢中的表達量最多，在脊索、精巢、肝盲囊和肌肉中的表達量依次減少，在后腸和鰓中的表達量較低。與Bjahr類似，Bjarnt在七種組織中也均有表達。Bjarnt在脊索和精巢中的表達量較高，在卵巢、鰓、肌肉和后腸中的表達量依次減少，在肝盲囊中的表達量最低。

(鰓：Gill；腸：Hind-gut；肌肉：Muscle；肝盲囊：Hepatic caecum；精巢：Testis；卵巢：Ovary, 脊索：Notochord。 從青島文昌魚肌肉、鰓、后腸、肝盲囊、卵巢、精巢和脊索不同組織中分別提取總RNA，采用qRT-PCR法檢測Bjahr (a)和Bjarnt (b)在不同組織中的表達量。 β-actin基因為內(nèi)參基因。Total RNAs were extracted from various tissues of B. japonicum, including the, and the relative expression of Bjahr (a) and Bjarnt (b) were determined in the different tissues by qRT-PCR. The β-actin gene was chosen as internal control for normalization.)圖7 Bjahr 和 Bjarnt 在7種組織的表達模式Fig.7 Expression profile of Bjahr and Bjarnt in 7 tissues of amphioxus

2.4 污染物PCB126脅迫后的表達分析

為了解環(huán)境污染物是否影響文昌魚ahr、arnt以及其他化學防御相關(guān)基因在肝盲囊中的表達，利用qRT-PCR檢測了PCB126 (3,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯)脅迫后不同時間點Bjahr、Bjarnt以及生物轉(zhuǎn)化酶基因cyp1、cyp3、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)基因和硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)基因的表達變化。Bjahr和Bjarnt在PCB126處理6和72 h后，表達量顯著升高，且這2個基因隨著處理時間的延長，表達變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的模式(見圖8)。文昌魚cyp1在處理后24 h表達顯著上升，而cyp3則在處理后72 h表達顯著上升，表明這2種cyp基因具有不同的表達模式。另外，gst在處理后12 和24 h表達量顯著升高，sult1a在處理后6、12和24 h表達量持續(xù)顯著升高。結(jié)果表明這些基因可能都參與解毒過程。

(處理6、12、24、48、72 h后，利用qRT-PCR分別檢測ahr (a)、arnt (b)、cyp1 (c)、cyp3 (d)、gst (e)和sult1a (f)的表達。β-actin為內(nèi)參基因。符號*表示顯著差異(P < 0.05)，符號**表示差異極顯著(P < 0.01)。The expression of ahr (a), arnt (b), cyp1 (c), cyp3 (d), gst (e), sult1a (f) were detected by qRT-PCR after exposing 6, 12, 24, 48 and 72 h. The β-actin gene was used as internal control for normalization. The symbol * indicated a significant difference (P <0.05), and the symbol ** indicated an extremely significant difference (P < 0.01).)圖8 濃度30 nmol/L的PCB126處理青島文昌魚后肝盲囊中Bjahr、Bjarn和化學防御基因的表達模式Fig.8 Expression profiles of Bjahr, Bjarnt and chemical defense related genes in hepatic caecum of B. japonicum exposed to PCB126 at doses of 30 nmol/L

2.5 重組蛋白AHR和ARNT的結(jié)合作用分析

為了解文昌魚AHR與ARNT能否相互相作用形成異二聚體，利用文昌魚體外重組蛋白AHR和ARNT開展ELISA結(jié)合實驗。由于AHR難以在體外獲得完整的純化蛋白，參考Tsuji等[18]方法，純化得到包含AHR的HLH和2個PAS結(jié)構(gòu)域的蛋白。生物素標記的AHR功能域蛋白能夠與ARNT結(jié)合，而作為對照組的BSA則顯示出與ARNT很弱的親和性(見圖9(a))。脊椎動物中，AHR配體PCB126的存在能夠促進AHR與ARNT形成異二聚體[11-14]。為了解文昌魚AHR與ARNT是否有類似的特性，將溶解于DMSO的PCB126與AHR和ARNT蛋白共同孵育。為排除溶劑DMSO的影響，溶劑對照組添加等量的DMSO與AHR和ARNT進行孵育。結(jié)果顯示，PCB126能夠促進文昌魚AHR和ARNT的結(jié)合。而作為對照組的BSA，在PCB126的存在下，仍顯示出與ARNT很弱的親和性(見圖9(b))。

((a) BjAHR與BjARNT的結(jié)合分析。(b) PCB126及其溶劑DMSO存在時，BjAHR與BjARNT的結(jié)合分析。牛血清蛋白BSA為對照。(a) Binding of BjAHR to BjARNT. (b) Binding of BjAHR to BjARNT when PCB126 and resolvent DMSO exist. BSA was used as control.)圖9 BjAHR與BjARNT親和力的ELISA分析Fig.9 ELISA analysis of the affinity of BjAHR to BjARNT

3 討論

化學防御系統(tǒng)是生物抵御環(huán)境中異生物質(zhì)如多環(huán)芳烴、微生物產(chǎn)物、重金屬、植物毒素等的重要機制[1-2]。芳香烴受體 (AHR) 和芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白(ARNT)同屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子超家族，在化學防御系統(tǒng)中作為化學感受器發(fā)揮作用[3-6]。脊椎動物AHR 作為重要的異生物質(zhì)受體蛋白，能夠被環(huán)境中的有毒物質(zhì)如PCBs、TCDD、PAHs 激活，并與細胞核中的ARNT形成異二聚物，進一步調(diào)控CYP等生物轉(zhuǎn)化酶以及轉(zhuǎn)運蛋白的表達[11-14]。然而，對無脊椎動物化學防御系統(tǒng)的研究中，目前還沒有直接證據(jù)證實無脊椎動物中存在同脊椎動物一樣的AHR-CYP信號途徑[5,15-17]。文昌魚作為研究脊椎動物起源的模式動物，其化學防御系統(tǒng)的作用機理至今仍不清楚。研究文昌魚AHR和ARNT在化學防御系統(tǒng)中的作用，對于了解脊椎動物AHR-CYP信號通路以及AHR蛋白作為異生物質(zhì)受體并參與化學防御的功能在系統(tǒng)演化中何時出現(xiàn)，具有重要意義。

本研究從青島文昌魚克隆得到了Bjahr與Bjarnt基因的ORF序列。功能域分析表明，這兩個蛋白都包含bHLH-PAS家族的特征功能域bHLH, PAS-A和PAS-B。蛋白三級結(jié)構(gòu)預測顯示，青島文昌魚AHR和ARNT蛋白結(jié)構(gòu)分別與人的同源蛋白結(jié)構(gòu)相似。這些結(jié)果均表明，本研究中克隆獲得了正確的目的序列。系統(tǒng)進化樹分析顯示，文昌魚AHR位于脊椎動物和無脊椎動物之間；而文昌魚ARNT則與無脊椎動物的ARNT類聚在一起并位于進化樹基部，這些結(jié)果說明文昌魚AHR和ARNT可能代表了較為原始的類型。

為了解Bjahr與Bjarnt的功能，首先分析了這2個基因的組織表達模式。Bjahr在鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索、精巢和卵巢這7種組織中都有表達，且在卵巢、精巢和脊索中表達量較高。哺乳動物AHR存在于多種組織和器官中，除了參與應答芳香烴類化合物，還參與多種生物信號轉(zhuǎn)導途徑，如細胞的生長和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，以內(nèi)分泌系統(tǒng)等[11,19-20]。AHR和ARNT在多種動物的精巢和卵巢中均有表達且參與調(diào)節(jié)生殖器官的生理功能[21-24]。AHR蛋白和轉(zhuǎn)錄本在包括靈長類、鼠、兔和豬等多類物種的卵巢細胞中表達，并且參與卵巢行使正常功能、建立最佳受精環(huán)境、滋養(yǎng)胚胎、維持妊娠、調(diào)節(jié)生殖周期和生育等生理功能[21-22]。此外，AHR和ARNT在鼠的精巢和人的精巢中均有存在，AHR在精子發(fā)育中起重要作用。與野生型精子相比，小鼠的Ahr敲除后，其精子的體外受精率顯著降低，且這些精子的頭部和尾部存在形態(tài)異常[23-24]。另外，脊椎動物AHR是包括神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)在內(nèi)的多種器官正常發(fā)育所必需的[25-26]。佛羅里達文昌魚2天齡幼體期，可觀察到Bfahr在嘴部周圍的細胞以及喙的表皮細胞中特異表達，而這些特異表達Bfahr的細胞可能參與化學感應作用[27]。青島文昌魚Bjahr在成魚的卵巢、精巢和脊索中高表達原因，以及其參與的生理功能仍需要今后進一步的研究。

與Bjahr的組織表達模式類似，Bjarnt在上述7種組織中也都有表達，且在脊索、精巢和卵巢中表達量較高。研究表明，ARNT在生物體內(nèi)廣泛表達，其主要功能是作為二聚化配體，與bHLH-PAS家族成員如AHR、HIF和SIM等蛋白形成異二聚體，進而激活或抑制下游基因表達[28-29]。因此，ARNT的功能發(fā)揮依賴于它的二聚化配體。而ARNT的二聚化配體的存在與否則依賴于各種因素，例如發(fā)育空間因素(果蠅的sim,trh,dys)，配體誘導因素(脊椎動物AHR)，低氧因素(HIF蛋白家族)。研究發(fā)現(xiàn)，佛羅里達文昌魚發(fā)育至神經(jīng)胚時期，可檢測到Bjarnt在胚胎背部的表達信號強烈，并且表達信號集中在靠近第一個體節(jié)的前端中樞神經(jīng)體統(tǒng)(CNS)，表明佛羅里達文昌魚bfarnt可能參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[27]。青島文昌魚Bjarnt在成魚的廣泛表達，可能與其他物種ARNT一樣，作為二聚化配體存在于各個組織中。然而Bjarnt在成魚的卵巢、精巢和脊索中高表達原因，且與Bjahr類似的組織表達模式是否因為兩者之間存在緊密的功能聯(lián)系，都需要今后進一步的研究。

脊椎動物中，已證實AHR-CYP信號通路在化學防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。然而無脊椎動物中是否存在同脊椎動物一樣的AHR-CYP途徑仍不清楚[5,15-17]。Hahn認為脊椎動物AHR經(jīng)歷了基因復制和功能多樣化，使其獲得能夠與二噁英類異生物質(zhì)結(jié)合的適應性能力[5]。而無脊椎動物AHR功能較為原始，主要在發(fā)育過程中發(fā)揮作用，缺少與二噁英類物質(zhì)結(jié)合的能力[5]。然而，最新研究顯示，經(jīng)環(huán)境污染物苯并(a)芘(BaP)、PCB126和TBT處理后，劍水蚤Tj-AhR和Tj-ARNT表現(xiàn)出時間依賴和劑量依賴的上調(diào)表達[16]。另外，在雌性櫛孔扇貝(C.farreri)中，低劑量苯并(a)芘能夠激活AHR、ARNT、CYP1A1以及雌激素受體的基因表達[17]。這些實驗結(jié)果則暗示劍水蚤和櫛孔扇貝中可能存在潛在的AHR-CYP信號通路。由此可見，無脊椎動物是否存在AHR-CYP通路仍然是一個具有爭議的論題。為初步探索文昌魚中是否存在類似脊椎動物的AHR-CYP通路，用環(huán)境污染物類二噁英多氯聯(lián)苯PCB126處理青島文昌魚，并用qRT-PCR檢測Bjahr、Bjarnt、cyp1、cyp3、gst和sult1a脅迫后的表達模式。結(jié)果顯示，基因Bjahr和Bjarnt在PCB126處理6 h后，表達顯著升高，且這兩個基因的表達模式類似。cyp1在處理后12 h后表達顯著升高。基因Bjahr、Bjarnt和cyp1在處理后均表達上調(diào)，暗示這些基因可能都參與化學防御過程，文昌魚中可能存在AHR-CYP信號通路。另外，生物轉(zhuǎn)化酶基因cyp3、gst、sult1a在脅迫后表達量也都顯著升高，暗示這些基因也都參與了文昌魚化學防御過程。

脊椎動物AHR被PCB126、二噁英等配體激活后，分子伴侶離解并導致AHR從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中，并與ARNT形成異二聚體，進而激活CYP1 家族基因以及其他生物轉(zhuǎn)化酶基因的表達[11-14]。為了進一步了解青島文昌魚AHR和ARNT蛋白能否形成異二聚體，開展了ELISA結(jié)合實驗。由于AHR蛋白難于純化獲得體外重組蛋白[18]，作者只表達和純化了AHR蛋白的bHLH和2個PAS功能域部分。結(jié)果顯示，青島文昌魚AHR功能域蛋白能夠與ARNT結(jié)合，并且脊椎動物AHR配體PCB126能夠促進這2個蛋白的結(jié)合。該實驗結(jié)果暗示，文昌魚AHR可能具有同脊椎動物AHR相似的功能，即能被二噁英類配體激活并與ARNT形成異二聚體。該發(fā)現(xiàn)不同于在尾索動物異體柱囊蟲(Oikopleuradioica)的化學防御系統(tǒng)研究結(jié)果。多環(huán)芳烴苯并芘(BaP)和藥類化合物降固醇酸(Clo)處理異體柱囊蟲后，未發(fā)現(xiàn)AHR和CYP1家族相關(guān)基因的表達。對異體柱囊蟲基因組進行搜尋，發(fā)現(xiàn)其缺失AHR通路的相關(guān)基因，如AHR和CYP1 家族的基因，表明異體柱囊蟲中不存在AHR-CYP通路[30]。另外，盡管?？写嬖贏HR和ARNT同源蛋白，但是?？腁HR和ARNT不能相互作用形成異二聚體[31]。本研究表明頭索動物文昌魚AHR和ARNT不僅具有結(jié)合能力，并且脊椎動物AHR的配體PCB126能夠促進這兩個蛋白的結(jié)合，因此推測文昌魚中可能存在類似脊椎動物AHR-CYP信號通路。

本研究從青島文昌魚克隆獲得ahr基因與arnt基因的ORF序列，分別命名為Bjahr和Bjarnt。這兩個基因都屬于bHLH-PAS家族且代表較為原始的類型。組織表達分析顯示，Bjahr和Bjarnt在鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索、精巢和卵巢這7種組織中都有表達，尤其在卵巢、精巢和脊索中表達量較高，相似的表達模式可能由于2個基因之間存在緊密的功能相關(guān)性，具體原因還需要今后進一步的研究。類二噁英PCB126處理后，Bjahr、Bjarnt以及生物轉(zhuǎn)化酶基因cyp1、cyp3、gst和sult1a表達均有顯著升高，因而推測這些基因參與文昌魚的化學防御過程。此外，作者還純化獲得文昌魚體外重組AHR功能域蛋白和ARNT蛋白。ELISA結(jié)果表明文昌魚AHR能夠與ARNT結(jié)合，并且脊椎動物AHR的配體PCB126能夠促進這2個蛋白的結(jié)合。根據(jù)這些實驗結(jié)果推測，文昌魚中可能存在類似脊椎動物的AHR-CYP信號通路。在今后的研究中，作者所在研究團隊還將進一步明確文昌魚AHR能否直接與二噁英等配體結(jié)合，以及文昌魚AHR和ARNT的二聚物能否調(diào)控其下游基因，以豐富對文昌魚AHR-CYP通路機制和進化地位的認識。