肝細胞癌（HCC）近幾十年來發(fā)病率上升，雖然在臨床和實驗性癌癥治療方面取得了很大進展，但由于術后腫瘤復發(fā)和轉移率高，HCC患者的總體預后較差。肝癌的發(fā)生發(fā)展可能是一個多因素、多步驟的過程，但目前關于其具體的分子機制尚不清楚。因此，更好地了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制對肝癌靶向治療具有重要意義。細胞外基質（ECM）由多種大分子組成，包括膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白、透明質酸和蛋白多糖。ECM作為腫瘤微環(huán)境中含量最豐富的成分，可以調控腫瘤細胞行為和腫瘤進展，膠原蛋白是ECM的主要成分，具有促進腫瘤發(fā)展的作用，例如I型膠原是主要的纖維膠原，在多種癌癥中高表達，通過促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質轉化(EMT)和化療耐藥促進癌癥的進展。Ⅳ型膠原是基底膜形成所需的非纖維性膠原，它促進腫瘤細胞粘附和遷移。

賦礦層礁灰?guī)r礁灰?guī)r存在許多孔隙，如沉積物原生孔洞（隙）、砂（礫）之間空隙、巖石（層）之間差異收縮裂（空）隙、層間裂隙等，這些孔洞（隙）成為儲礦空間含礦。

脯氨酸4-羥化酶II（P4HA2）是膠原蛋白形成的關鍵酶，可以催化膠原蛋白中的脯氨酸羥化，形成羥脯氨酸，促進膠原蛋白形成正確的空間結構。P4HA2可以通過增加膠原的生成來調節(jié)癌細胞的行為，P4HA2與缺氧、膠原蛋白的沉積、糖酵解以及癌細胞的遷移侵襲有很大的相關性，并且P4HA2在許多腫瘤中表達增加，如乳腺癌、前列腺癌和宮頸癌。有研究表明阿司匹林通過抑制NF-κB 和LMCD1-AS1/let-7g軸靶向調控P4HA2來抑制肝癌的進展，但現有研究未進一步闡明P4HA2與肝癌之間的分子機制。

本研究利用數據庫對P4HA2的表達及預后進行預測，之后構建P4HA2沉默模型，通過功能缺失性實驗來觀察P4HA2在肝癌細胞系中的增殖、遷移侵襲作用，旨在闡明P4HA2通過激活PI3K/AKT/mTOR通路來促進肝癌細胞的發(fā)生發(fā)展，為肝癌的診斷及治療尋求新的腫瘤標志物及腫瘤治療的新靶點。

在哈貝馬斯看來，只有到了晚期資本主義社會，科學技術才成為一種意識形態(tài)，而不是馬爾庫塞所認為的任何社會階段。在晚期資本主義社會中，科學技術成為意識形態(tài)并具有了與舊意識形態(tài)不同的新意識形態(tài)特點:

1 材料和方法

1.1 材料

5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。

1.2 方法

造成列車通信網絡故障的原因多種多樣。從表面上來看，故障主要表現為整個網絡通信不穩(wěn)定、多個設備頻繁離線，或者某一個設備離線。對于第一種故障情況，故障原因往往較為復雜，這里不做詳述，本文將重點針對第二種故障情況進行研究和分析，結合現場實際發(fā)生的故障深入探究。

其一，履行判決。依據《行政訴訟法》第78條，行政機關不依法履行、未按照約定履行行政協議的，人民法院判決行政機關承擔繼續(xù)履行、采取補救措施或者賠償損失等責任。依據《稅收征管法》的規(guī)定，納稅人在提起行政訴訟之前存在著“納稅前置”。如法院認為預約裁定合法有效且納稅人的交易事項確乎符合裁定約定的，應判決稅務機關履行預約裁定，稅務機關應向納稅人返還多繳納的稅款并且向納稅人賠償多繳納的稅款在此期間所產生的利息損失(建議按同期銀行貸款利率計算)。另外，如果稅務機關在預約裁定中對稅法作出的行政解釋與上位法相抵觸，但納稅人屬于善意不知情的情況下，基于信賴保護原則，法院仍應作出履行判決。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系（SMMC-7721、Hep-G2、HUH7、SNU-449和Hep3B）和人正常肝細胞（L-02）分別在含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃，含5%CO的細胞培養(yǎng)箱中，1～2 d換液，待細胞長到90%以上傳代或繼續(xù)其他實驗。

式中，|[Hvr(r2,r1，ωi)|描述了幅頻特性；φvr(r2,r1，ω)描述了相頻特性。φvr(r2,r1，ω)的計算公式為

1.2.3 慢病毒轉染 以攜帶特異性針對人P4HA2基因的shRNA 重組慢病毒載體（shP4HA2-1、shP4HA2-2、shP4HA2-3）感染Hep3B和SNU449細胞，構建P4HA2低表達的SNU-449和Hep3B細胞，以shRNA-陰性對照為對照組（NC），轉染后用嘌呤霉素篩選。干擾序列見表1。

1.2.4 qRT-PCR 細胞經慢病毒轉染后使用Trizol提取總RNA，并逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參進行PCR擴增。引物序列如下：

5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，

5'-GGCCTGGTTTGGTGTCCTG3'，

等效電流源iP(t)繼續(xù)減小,當電流源為負半周期時,VA>VB時,PMOS管MP 1截止,比較器CMP2輸出低電平,NMOS管MN2也截止。同理,整流電路可以被劃分為與輸入信號正半周期對應的3種操作狀態(tài)。

P4HA2-Reverse:

5'-GCCCAGCTCTTAATCTTGGAAAG3'。

β-Actin-Forward:

P4HA2-Forward:

（3）冷卻結晶。四鉬酸銨溶于氨溶液后生成正鉬酸銨溶液，通過自然冷卻，鉬即以七鉬酸銨結晶析出。其反應式如下：

2001-2012年海南省入境旅游者人均天消費總體呈波動上升趨勢，增長了30.03美元，排名從第二十五名上升至第二十名。人均天消費與全國平均值差距越來越小，縮小了9.3美元。其中外國游客人均天消費增長了20.9美元，港澳臺游客人均天消費增長了146.6美元。同時，港澳臺游客人均天消費的增長量大于外國游客，約是外國游客的5倍。其12年間增長的速度也比外國游客增長的速度快，增長了8.65%。海南省入境旅游者人均天消費構成中，長途交通所長比重較大。2012年海南省入境旅游者人均天消費主要在提高層次方面的消費，在購物和娛樂方面消費較多，說明海南省旅游業(yè)發(fā)展越來越健康。

β-Actin-Reverse:

人肝癌細胞系SNU-449、Hep-3B（武漢普諾賽公司）。sh-P4HA2 慢病毒構建由武漢漢恒生物公司構建完成，胎牛血清（clark）；DMEM、1640 培養(yǎng)基（Gibco）；CCK-8 試劑盒（碧云天）。Tranwell 小室（Corning），P4HA2、E-cadherin、N-cadherin、snail、β-actin、p-Akt 抗體（Proteintech）；p-PI3K（ABcam）；p-mTOR（Cell Signaling Technology）。

采用qRT-PCR和Western blot法檢測肝癌細胞株和正常肝細胞中P4HA2的表達，結果顯示，與正常肝細胞L-02相比，P4HA2在肝癌細胞株SNU-449、HepG2、Huh7、Hep3B中的表達均增加，差異有統計學意義，其中Hep3B中的表達增強最為明顯（＜0.01，圖1E、F）。因此選擇Hep3B和SNU-449細胞系進行后續(xù)實驗。

1.2.6 創(chuàng)傷愈合實驗 細胞接種于六孔板中，24 h后用10 μL短槍頭劃痕，PBS洗滌后加入完全培養(yǎng)基，觀察0 h、24 h 后遷移情況，用顯微鏡拍攝細胞間隙，用ImageJ軟件分析。

1.2.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 用胰酶消化各組細胞并計數，在無血清培養(yǎng)基中制備細胞懸液，密度為5×10/孔。對于細胞侵襲，Matrigel解凍后用基礎培養(yǎng)基稀釋10倍，然后加到上層小室，放入37 ℃培養(yǎng)箱中1～2 h。之后將細胞接種于涂有Matrigel的上室，下室加入800μL完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。對于細胞遷移，使用無Matrigel的小室，同樣方法培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，然后用純水洗滌漂浮色，棉簽拭去未穿過的細胞并在光學顯微鏡下觀察拍照。

(1) F1斷層：位于區(qū)內近東西向山梁的東側、西側山溝的西部邊緣，走向北北東10°～20°，傾向南東，傾角50°～70°。正斷層，斷層帶兩側地層明顯錯動，巖層破碎，地形上多呈陡坎或沖溝，富水性好。

1.2.8 克隆形成實驗 將shP4HA2組和NC組按500/孔接種到六孔板中，培養(yǎng)5 d左右，待長出可見的細胞團即可固定染色，拍照計數。

1.2.9 熒光克隆實驗 將兩組細胞分別接種到96孔板中（2000/孔），并在溫箱中孵育5 d，每天用熒光顯微鏡拍照測定。

1.2.1 生物信息學分析 通過GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）、Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）分析P4HA2的表達及相關指標，KM plotter（http://kmplot.com/analysis/）數據庫評估P4HA2的預后作用。

1.2.10 Western blot 收取shP4HA2組和NC組細胞，加入適量RIPA、PMSF冰上裂解，BCA法蛋白定量。SDSPAGE電泳分離后，然后轉至PⅤDF膜上。室溫下快速封閉液封閉15 min，隨后一抗（1∶1000）在4 ℃下搖床過夜，次日用二抗孵育2 h，TBST洗膜3次之后ECL顯影，檢測蛋白條帶。

1.3 統計學分析

實驗數據采用SPSS16.0、Graph Pad軟件進行統計分析。所有實驗均重復3次，定量數據采用均數±標準差表示，兩組間比較采取獨立樣本檢驗，多組間比較采用方差分析。＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 P4HA2在肝癌細胞中的表達情況與預后關系

GEPIA數據庫結果顯示，與癌旁組織相比，P4HA2在肝癌組織表達上調（160例為癌旁組織，369例為肝癌組織）（＜0.05，圖1A）。HPA數據庫P4HA2在蛋白水平表達上也顯示升高（圖1B）。在線數據庫GEPIA、Kaplan-Meier Plotter評估P4HA2在HCC患者中的預后,結果顯示，P4HA2的表達越高，HCC患者的總生存率和疾病特異性生存期越短（＜0.05，圖1C、D）。

1.2.5 CCK-8實驗 在Hep-3B細胞中，將shP4HA2組和NC 組按2000/孔接種到96 孔板中，SNU-449 細胞3000/孔。復孔5個/組，分別于24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h后，檢測吸光度值。

2.2 構建P4HA2沉默模型

攜帶P4HA2 shRNA的慢病毒轉染肝癌細胞，qRTPCR和Western blot檢測在Hep3B和SNU-449細胞系中shP4HA2組的P4HA2 mRNA和蛋白表達效果，其中shP4HA2-3組的沉默效果最好（＜0.05，圖2）。因此選擇shP4HA2-3進行后續(xù)試驗。

2.3 沉默P4HA2抑制Hep3B和SNU-449細胞的增殖

熒光克隆實驗結果顯示，shP4HA2組細胞較NC組細胞增殖能力下降（＜0.05，圖3A）；CCK-8實驗結果顯示，與對照組相比，沉默P4HA2 基因抑制Hep3B 和SNU-449細胞系的增殖活力（＜0.05，圖3B）；細胞克隆形成實驗顯示，shP4HA2組細胞的集落數目較NC組明顯減少，集落數目差異有統計學意義（0.01，圖3C）。

2.4 沉默P4HA2抑制Hep3B和SNU-449細胞的遷移和侵襲能力

創(chuàng)傷愈合實驗顯示，與NC 組相比，shP4HA2 組24 h劃痕寬度較寬，沉默P4HA2降低了Hep3B和SNU-449細胞的創(chuàng)傷愈合能力（＜0.01，圖4）。Transwell小室實驗結果顯示，shP4HA2組與NC組相比，24 h穿過小室膜的遷移和侵襲細胞數目明顯減少（＜0.01，圖5）。

2.5 沉默P4HA2阻礙肝癌細胞系上皮-間質轉化

Western blot結果顯示，shP4HA2組E-cadherin的蛋白表達水平較NC組增加，而N-cadherin和Snail的表達下降（＜0.05，圖6）。

2.6 沉默P4HA2抑制Hep3B和SNU-449細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活

Western blot結果顯示，與NC組相比，sh-P4HA2組抑制了Hep3B和SNU-449細胞中p-PI3K、p-Akt和pmTOR蛋白的表達（＜0.05，圖7）。

3 討論

肝癌的發(fā)展經常與炎癥和纖維化相關。其中，細胞外基質的沉積在纖維化過程中起著重要作用，例如它可促進細胞生長、存活、遷移、粘附、血管生成，進而導致癌癥進展。膠原作為細胞外基質中含量最豐富的成分，通過提高組織的硬度和抗拉強度，來維持細胞外結構。P4HA2是膠原合成的關鍵蛋白，在促進腫瘤的進展中起著重要作用。它參與了多個生物學過程，如膠原成熟、上皮間質轉化、腫瘤進展中ECM的異常構建以及阿爾茲海默癥中淀粉樣蛋白β的沉積。P4HA2與肝纖維化相關性肝癌的發(fā)生有關，因此研究P4HA2在肝癌中的表達具有重要意義。本研究通過GEPIA、Human Protein Atlas數據庫顯示，與癌旁組織相比，P4HA2在肝癌組織中表達增高。Kaplan-Meier Plotter數據庫分析P4HA2與腫瘤預后的關系，結果顯示P4HA2表達越高，預后越差，總生存率、疾病特異性生存期均顯著縮短。Western blot和QRT-PCR結果也顯示，與正常肝細胞L-02相比，P4HA2在其他肝癌細胞中表達增加，與生物信息學分析結果一致。

P4HA2在多種腫瘤中表達增加，其過表達與腫瘤的增殖、轉移、預后有密切的相關性。有研究發(fā)現在口腔鱗狀細胞癌中，P4HA2的表達上調與轉移密切相關，P4HA2可通過誘導膠原沉積促進乳腺癌轉移。本研究為了驗證P4HA2與肝癌細胞的功能，用攜帶P4HA2 shRNA的慢病毒載體轉染肝癌細胞系Hep-3B、SNU-449，構建沉默表達模型。CCK-8、克隆斑、劃痕、transwell等實驗結果顯示沉默P4HA2后肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，提示P4HA2在肝癌的發(fā)展進程中發(fā)揮著重要的作用。EMT常發(fā)生于腫瘤細胞侵襲和轉移的早期階段，細胞經歷從上皮極化到間充質成纖維細胞的形態(tài)轉化，參與侵襲、血管生成和轉移相關的化療耐藥。已有文獻報道膠原蛋白的生物合成和沉積與癌癥進展中的EMT過程密切相關。在膠質瘤細胞中，P4HA2通過膠原依賴的PI3K/AKT通路激活EMT促進癌癥的進展。本研究發(fā)現在肝癌細胞系Hep3B和SNU-449中沉默P4HA2后，E-cadherin的表達增加，N-cadherin、Snail的表達下降，從而抑制腫瘤細胞EMT的過程，這些發(fā)現揭示了P4HA2通過EMT過程抑制HCC細胞遷移和侵襲。

PI3K/Akt/mTOR信號通路調控多種細胞功能，如增殖、存活、遷移和代謝；并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在非小細胞肺癌中，PI3K/AKT/mTOR通路與腫瘤發(fā)生和疾病進展密切相關。在乳腺癌中，PI3K/AKT/mTOR與細胞轉化、腫瘤發(fā)生、癌癥進展和耐藥性相關。本研究利用Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白的表達，實驗結果顯示，P4HA2基因被敲除后，p-PI3K、p-AKT和p-mTOR均受到抑制，而總蛋白卻沒有發(fā)生明顯改變，表明P4HA2可能通過影響PI3K/AKT/mTOR途徑而調控肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。本實驗對P4HA2和HCC之間做了初步的體外實驗，并且進行了部分凋亡方面的預實驗，但實驗結果總是容易反復，需進一步進行探索。所以要徹底了解P4HA2其內在機制，需要進行包括體內實驗在內的一系列深入研究。

綜上所述，本研究結果表明P4HA2在肝癌細胞中上調，可能通過PI3K/AKT/mTOR通路促進肝癌細胞的發(fā)生和發(fā)展，為肝癌的診斷及治療尋求新的腫瘤標志物及腫瘤治療的新靶點提供理論依據。